トランスファーRNA修飾酵素によるタンパク質品質管理機構の解明

2023 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 21K05272
• 研究機関: 産業医科大学
• 研究代表者: 坂口 怜子 産業医科大学, 医学部, 講師 (80723197)
• 研究期間 (年度): 2021-04-01 – 2025-03-31
• キーワード: イオンチャネル / シグナル伝達

研究実績の概要

細胞を構成する酵素・細胞骨格・抗体などを形作るタンパク質の合成機構は、全ての生物において共通であり、生命維持の根幹を成すシステムである。必要なときに必要なタンパク質を必要な量だけ発現させる仕組みにおいて、そのアミノ酸配列を正確に翻訳することは、タンパク質の品質管理上で一番重要である。そのため、遺伝暗号に従ってリボソーム上にアミノ酸を正しい順番で運ぶトランスファーRNA（tRNA）には、その正確さを担保するための仕組みが備わっている。tRNAが機能を発揮するためには、転写後に必要な修飾を受けた上で、各コドンに対応するアミノ酸でアミノアシル化されてリボソームに取り込まれる必要がある。修飾を担う酵素が選択性や反応速度などの点で正しく機能しなくなると、誤ったアミノ酸の取り込みや読み枠のズレなどによりタンパク質の品質が低下し、生体応答に異常をきたす。特に、メッセンジャーRNAとリボソーム上で塩基対を形成して特異的なアミノ酸認識に関わる、tRNAのアンチコドン領域（34～36位）とその周辺の配列の適切な修飾は、アミノ酸を正しい配列で結合させていく上で重要である。
tRNAの修飾のうちの一つである36位グアノシンのメチル化は、ワトソンークリック型の塩基対形成を阻害することで、タンパク質翻訳における読み枠のズレを防止する役割を担う。このメチル化を担う酵素は原核生物(TrmD)と真核生物(Trm5)で異なっており、原核生物のTrmDの欠損は致死性である。そして、原核生物の酵素のみ、その活性にCa2+、Mg2+、Mn2+などの2価金属イオン要求性がある。
そこで本研究では、この酵素活性に必須の金属イオンの細胞内濃度を制御している機構の解明を目指して、イオンチャネルの変異体の活性評価や、阻害剤の効果の検証を行なった。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

本研究では、細胞内の金属イオンの濃度を制御する機構を明らかにすることを目的としている。具体的には、酵素の活性中心における金属イオン要求性や、その上流でイオン濃度を制御している分子実態の探索、その制御が機能しない場合の応答の変化と疾病との関連性の解明を目指している。本年度も前年度に引き続き、細胞内の金属イオン濃度を制御するイオンチャネルの分子実体として、外界の環境変化を感知してCa2+などを細胞内に流入させる非特異的陽イオン透過チャネルであるTransient Receptor Potential (TRP) チャネルファミリーの変異体の機能評価ならびに阻害剤の評価を行なった。
TRPファミリーは温度、 pH、レドックス環境、機械刺激など、それぞれが固有の刺激で活性化することが知られている。本年度は、腎障害患者から同定されてきたTRPCチャネル変異体の機能評価を行った。モデル生物として腎臓由来細胞を用いて、作製した変異体を遺伝子導入により発現させ、定常状態や受容体刺激時の細胞内Ca2+濃度の変化を測定した。評価した変異体のうち、数種類は細胞内へのCa2+流入量が減少し、数種類はCa2+流入能力が上昇していることを見出した。総合して、患者由来の遺伝子変異では、その臨床的な重篤さの度合いに応じて細胞内Ca2+流入能力が向上していることが明らかになった。そこで、チャネル機能の異常向上が疾患と関連することから、発症の抑制と進行を遅らせることを目指して、TRPCチャネルの阻害剤の評価を行った。
さらに、チャネル機能が異常に向上した変異を持つモデルマウスの作製に着手したが、本年度より別の競争的資金が採択され、本研究に対するエフォート率が下がったため、研究の進捗がやや遅れている。当初の計画では本年度中に変異マウスの評価まで行う予定であったが、来年度に行う見込みである。

今後の研究の推進方策

前年度までの成果で、HEK293細胞や膵細胞、腎細胞をモデル生物として用いて、膵炎や腎障害の患者から同定されたTRPチャネルの様々な変異体を遺伝子導入により発現させ、細胞内Ca2+濃度の変化を測定したところ、複数の変異体でCa2+流入能力が変化（向上、低下の双方）しており、患者由来の遺伝子変異では、その臨床的な重篤さの度合いに応じて細胞内Ca2+流入能力が向上していることが明らかになった。今後の方針として、各変異体の、Ca2+以外の金属イオン（Mg, Zn, Fe, Coなど）に対する透過性（選択性の変化）を評価したり、イオンチャネルに対する阻害剤の効果（作用機構への影響）を評価したりする。
また、TRPCチャネル機能の異常向上が疾患と関連することから、チャネル機能が異常に向上した変異を持つモデルマウスをCrispr-Cas9法で作製し、第１世代が生まれてきたところである。今後、この変異マウスたちの遺伝型を同定した後、組織を採取し、細胞骨格の形成やタンパク質産生における品質の変化があるか評価する。表現型の有意な差が観察された場合、TRPCチャネルの阻害剤をマウスたちに投与し、表現型の改善が見られるか評価を行う。

次年度使用額が生じた理由

本研究では、研究遂行に必要な細胞培養皿・試薬類の購入にあたり、所属している研究室で進行している他の研究課題で使用する分と共に一括購入したため単価が下がり、当初予定していた予算より安い価格で購入する事が出来た。また、大学の運営する共同利用研究センターの機器類を積極的に活用することにより、所属研究室で所有している蛍光顕微鏡類に付随する消耗品などにかかる経費を削減できた。
一方で、本年度より別の競争的資金が採択され、本研究に対するエフォート率が下がったため、当初の計画よりも研究の進捗がやや遅れており、１年間の延長を申請した。そのため、余剰予算は次年度において、今年度評価できなかったイオンチャネルに対する阻害剤の購入や、新規作製した遺伝子編集マウスの繁殖・維持・凍結胚作製などに充てる予定である。

研究成果

• [学会発表] Dynamic remodeling of TRPC5-caveolin-1-eNOS complexes regulates the precise signal transfer between Ca2+ and NO (2024)
  • 著者名/発表者名: Reiko Sakaguchi, Nobuaki Takahashi, Takashi Yoshida, Nozomi Ogawa, Yoshifumi Ueda, Satoshi Hamano, Kaori Yamaguchi, Seishiro Sawamura, Shinichiro Yamamoto, Yuji Hara, Tomoya Kawamoto, Akito Nakao, Masayuki X. Mori, Tetsushi Furukawa, Shunichi Shimizu, Ryuji Inoue, and Yasuo Mori
  • 学会等名: 第101回 日本生理学会大会
• [学会発表] Effect of novel selective TRPC3/6 dual inhibitor L862 to rat PAN-induced nephropathy (2023)
  • 著者名/発表者名: Reiko Sakaguchi, Yoshimune Matsuda, Ryo Okada, Marie Konomi, Takanori Kihara, Takeshi Yamamoto, Yoshitaka Isaka, Ryu Nagata, Masayuki X. Mori
  • 学会等名: 第97回日本薬理学会年会
• [学会発表] イオンチャネル機能と連動する蛋白尿におけるバイオマーカーの探索 (2023)
  • 著者名/発表者名: 松田 由宗、坂口 怜子、岡田 亮、木原 隆典、永田 龍、森 誠之
  • 学会等名: 第96回日本生化学会大会
• [学会発表] 蛋白尿改善を目指したイオンチャネル阻害剤の 開発と評価 (2023)
  • 著者名/発表者名: 坂口 怜子, 松田 由宗, 岡田 亮, 石兼 真, 高橋 富美, 片渕 瑛介, 中山 敏幸, 眞田 賢哉, 上田 陽一, 木原 隆典, 永田 龍, 森 誠之
  • 学会等名: 令和５年度 産業医科大学学会