| 研究課題/領域番号 |
21K05301
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
日高 興士 神戸大学, 保健学研究科, 非常勤講師 (30445960)
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| 研究分担者 |
安達 基泰 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 量子生命科学研究所, 上席研究員 (60293958)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 酵素活性 / 阻害剤 / ストレプトアビジン / ビオチン / プロテアーゼ / Mpro / SARS-CoV |
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| 研究実績の概要 |
本研究課題では、感染細胞に由来する新型コロナウイルスの2種のプロテアーゼを標的にリムーバブル阻害剤を各種合成し、モデル検体から親和性競合による酵素活性の検出を行い、感染細胞の有無の判定につながる画期的な検査薬の開発に向けて新型コロナウイルスの正確で簡便な新規検出法の確立をめざす。
今年度はストレプトアビジンの添加による親和性競合の評価を行うための４種の新規蛍光基質を合成した。また、MproおよびPLproのリコンビナントタンパク質を調製し精製した。次に、SARS-CoV-2のMpro複合体のX線構造情報より後にFDA承認された阻害剤ニルマトレルビル（PF-07321332）のビオチン化部位を決定してビオチン誘導体の合成を検討した。
研究開始当初はPF-07321332との複合体情報が未公開であり、タンパク質データバンクよりSARS-CoV-2Mproと阻害剤N3(6lu7)およびボセプレビル(7c6s)の２つの結晶構造を重ね合わせ、共通する部分構造からPF-07321332の複合体モデルを構築した。結合様式からビオチン化部位はポケットが広く受け入れられる阻害剤のN末端が適すると判断した。C末端をアミド体として合成を進めたが、最終目的物は同定できなかった。原因として側鎖ピロリジノン環を持つアミド体である中間体や目的物の高い水溶性や芳香族のUV吸収がない反応追跡の難しさが考えられる。
今後は公開されたPF-07321332の合成経路を参考に経路を修正し、リムーバブル阻害剤の合成を再検討し、リコンビナント体Mproを用いて共結晶構造の解析や生体資料からの酵素活性の検出を進める。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
M. Dragらの報告を基にMproの酵素反応に用いるペプチド基質配列を選択し、蛍光基としてAMCおよびPhodaminを導入した基質を4種類合成した。
MproおよびPLproのリコンビナントタンパク質を調製して精製した。
ファイザー社が開発したSARS-CoV-2 Mproの可逆型阻害剤PF-07321332に着目し、ビオチン誘導体の合成を検討した。研究開始当初はPF-07321332との複合体情報が公開されていなかったため、タンパク質データバンクよりSARS-CoV-2Mproの阻害剤N3との複合体(6lu7)とボセプレビルとの複合体(7c6s)の構造を重ね合わせ、PF-07321332と共通する部分構造を取り出して化学構造を構築し、エネルギー最小化計算により複合体モデルを構築した。このモデルの結合様式からビオチン化部位は阻害剤のN末端が適すると判断した。合成経路は当初は未報告であったため、C末端をアミド体で出発し、３つの非天然アミノ酸をペプチド縮合剤により結合して伸張した。そして、N末端をビオチンのカルボキシ基と縮合してトリフルオロ酢酸無水物によるC末端アミドのニトリル変換を行った。しかし、最終目的物は同定できなかった。この原因として、側鎖ピロリジノン環を持つアミド体および合成中間体の水溶性が非常に高いことや、中間体や目的物は芳香族のUV吸収がなく各反応の追跡が難しいことが考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後はSARS-CoV-2 Mproの阻害剤のビオチン化については公開されたPF-07321332の合成経路を参考に経路を修正し、リムーバブル阻害剤を獲得する。PLproについては既知の可逆的阻害剤から結合を妨げない部位にビオチンを繋いだ誘導体を獲得する。精製したMproおよびPLproのリコンビナント体とビオチン化阻害剤との共結晶構造を解析してビオチン化部位の最適化を図る。生体資料にMproおよびPLproを混入し、磁気ビーズによるアフィニティー精製と親和性競合を組み合わせた手法により各酵素活性を検出する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
計画した国際プロテオリシス学会学術集会が２年後へ延期となり、旅費が大きく余った。次年度以降の国際学会での成果発表に計画を変更した。また、ビオチン化阻害剤の合成が予定よりも少し遅れており、合成後に検討する親和性競合試験に用いるストレプトアビジンや生体資料は使用期限があるため購入を見送った。これらの消耗品は次年度に購入する予定である。
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