| 研究課題/領域番号 |
21K05303
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
村井 勇太 北海道大学, 先端生命科学研究院, 助教 (20707038)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | スフィンゴミエリン合成酵素２ / 光アフィニティーラベル / クリックケミストリー / スフィンゴ脂質 / 化学プローブ |
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| 研究実績の概要 |
本年度は、昨年度作成に成功したスフィンゴミエリン合成酵素2（SMS2）選択的な阻害剤を搭載したノシルジアジリン型光アフィニティーラベル (NsPAL)プローブを用いてSMS2釣り上げ実験を実施した。NsPALプローブならびに検出タグ、光ラベル架橋時間の条件検討を幾度と行ったが、残念ながら目的であるSMS2（分子量43kDa）のバンドを検出するに至らなかった。そこで、代替案として準備していたSMS2阻害剤に直接ジアジリン基およびアルキンタグを導入した第二のアルキン型PALプローブの作成を行なった。12ステップで目的のアルキン型PALプローブの作成に成功し、またSMS2阻害活性を評価したところSMS2選択性およびIC50値:40 nM（オリジナル20 nM）を維持していることを確認した。続いて、新たに作成したPALプローブを用いて、SMS2釣り上げ実験を実施した。今回、光ラベル後の検出基導入についてはPALプローブ中のアルキンを利用したクリックケミストリーによってビオチン導入を実施した。ビオチン導入後はアビジン精製、SDS-PAGEを行い、最後にSMS2に導入してあるFLAGタグの抗体検出によって釣り上げの評価を行なった。また比較実験として、1)PALプローブのみを用いたケース、2)PALプローブと競合剤を用いたケース、3)PALプローブを用いないケースをSMS2過剰発現させたHEK293ライセートと過剰発現させていないHEK293ライセート（ネガティブコントロール）で実施した。その結果、通常のHEK293ライセートでは43kDa付近のバンドは一切確認されなかった。いっぽう過剰発現細胞ではPALプローブの有無でバンドの濃さに大きな差があり、また競合剤をいれたものは若干バンドが薄いことも確認できた。現在は、このバンドをゲル内消化し、MS/MS測定に移行している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
最初に予定していたNsPALプローブでは、SMS2の釣り上げに至らなかったものの、代替のアルキン型PALプローブの合成およびPAL実験の移行まで進捗した。さらにSMS2釣り上げ実験では、ネガティブコントロールならびにPALプローブの有無によって目的のSMS2バンドの検出に明瞭な差がでており、SMS2の釣り上げ成功が期待できるレベルまで到達できた。現在、MS/MS解析まで移行しており、残りの一年で結合部位解明の期待がより一層高まったと言える。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、MS/MS解析による解析結果によって成功した場合は、現在共同研究を実施している理研の本間博士と計算科学を用いた阻害剤とタンパクのドッキングシュミレーションを予想する。さらに、よりSMS2の活性ポケットにフィットする低分子化合物の立案を行う。まだ釣り上げがうまくいっていない場合は、SMS2量をより多く確保し、再度釣り上げ実験に挑戦する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
未使用額が生じたのは今年度の研究計画が予定通り遂行でき、無用な執行は行わず、次年度の研究に役立てようと考えたためであり、次年度の試薬代等に使用す
る予定である。
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