| 研究課題/領域番号 |
21K05304
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| 研究機関 | 富山大学 |
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研究代表者 |
友廣 岳則 富山大学, 学術研究部薬学・和漢系, 教授 (70357581)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | photoaffinity labeling / diazirine / chemical probe |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、多機能を集積した独自の発蛍光性光クロスリンカーを基盤技術として、従来法では困難であった複数のラベルペプチド解析に基づいた標的タンパク質の同定を達成し、同定法としての信頼性を上げるとともに結合構造情報獲得を目的とする。そのため小型で柔軟性のあるアルキル型ジアジリン基を導入した桂皮酸型光クロスリンカーを作製し、そのリガンドプローブによる炭酸脱水酵素ラベルにおいて、ラベル収率の向上と蛍光強度の増強、リガンド相互作用部位近傍アミノ酸残基のラベル化を達成した。しかし、1,2-水素転移などジアジリン光反応の副反応が増加したため、これを抑制するためにトリフルオロメチル置換型アルキルジアジリン誘導体を新たに設計、合成した。このジアジリン誘導体の光クロスリンク反応は340 nm以下のやや低波長領域の光照射を必要としたが、これを導入した桂皮酸ユニットでは、従来反応基と同様に光E-Z異性化を経由したクマリン環化が進行し、発蛍光性／切断特性を示した。続いてエチニル基を有する桂皮酸型光反応基、さらにアジド基を有する桂皮酸型光反応基に誘導し、後述のCuAAC反応に対応可能な各種反応基を作製した。微量のラベルタンパク質解析にはビオチン－アビジンを利用した濃縮精製が必須となる。この目的にはまず小型の化学リポータータグをまず導入し、その後ビオチン基を導入する方法が有効であり、生体直交反応性を示す銅触媒アジド－アルキン環化付加反応（CuAAC）が汎用される。極微量の光ラベルタンパク質を効率よくビオチン化するために、別途、アジド基導入ペプチド銅配位子を開発したところ、そのCuAAC反応速度は大幅に向上した。さらにエチニル基導入ペプチド配位子も作製した。以上、本研究では微量光ラベルタンパク質解析のための基盤技術を開発した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究では光ラベル部位解析効率を向上した独自の反応基をさらに改善し、その課題であったラベル収率やラベル部位、解析システムの効率化を目的とした。光ラベルに関する課題に対して開発した新規光クロスリンカーはそのラベル収率などを大きく向上させた。ただし副反応が生じることが判明したため、それを抑制するための新たな改良を加えた光クロスリンカーを設計し、一連の誘導体を合成することができた。一方、解析システムの効率化では、用いるCuAAC反応の更なる高速化に成功し、極微量ラベルタンパク質の解析に対応できるシステムにした。
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| 今後の研究の推進方策 |
最初に開発した光クロスリンカーにおける課題の克服のために、必要な機能を保持したまま、新たな改良を加えた新規光反応基の合成ルートの検討を行い、複数誘導体を合成した。これにより、新しい光クロスリンカーを用いたタンパク質ラベルの検討は十分ではない。新規ジアジリン誘導体における光反応特性の詳細な解析を進めつつ、タンパク質ラベル解析における効率評価を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
光ラベル法による微量標的タンパク質の同定やリガンド結合解析の効率化を目的としている。本目的のため設計、合成した光反応基によりラベル収率や蛍光強度の向上などいくつかの機能向上を達成した。しかし副反応が見られたため、新たな改良を加える必要が生じ、それら課題に対処するために、別途、いくつかの反応基を開発するに至った。補助事業期間を延長し、光反応基およびその光プローブの詳細データを収集し、さらにそれらを用いたタンパク質解析など、以下に示す追加実験を行う予定である。
１． 新規光反応基をリガンドに導入した光プローブの作製、およびそれらの物性および光反応性に関する詳細なデータの収集
２． 新規光プローブを用いたタンパク質ラベル、およびその解析システムの効率評価
以上の研究を行うにあたり、化合物合成に関する試薬・溶媒、タンパク質解析に関する生化学試薬、および解析機器使用費、学会や論文発表費などに使用する。
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