| 研究課題/領域番号 |
21K05311
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| 研究機関 | 高知大学 |
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研究代表者 |
和泉 雅之 高知大学, 教育研究部総合科学系複合領域科学部門, 教授 (80332641)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | タンパク質化学合成 / 化学選択的縮合反応 / セレン / リシン / ユビキチン |
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| 研究実績の概要 |
タンパク質のユビキチン修飾は、不要タンパク質の分解、DNA修復、炎症、アポトーシスなど多彩な生命現象に関わっており、がんや神経変性疾患の原因ともなることから、ユビキチン化の機能解明のためのプローブとなるユビキチン修飾タンパク質の合成法が盛んに研究されている。タンパク質には反応点となるカルボキシ基とアミノ基が多数存在するため、プローブを短工程で効率的に合成するためには選択的縮合反応の開発が必要である。化学選択的なユビキチン化反応として、Brikらのδ-メルカプトリシンを介したイソペプチドケミカルライゲーション法がある。我々は、セレンの高い反応性に着目しδ-メルカプトリシンの硫黄原子をセレン原子に置換したδ-セレノリシンを介したペプチドチオエステルとの連結反応を新たに開発している。本研究では、その発展としてペプチドセレノエステルを利用することで、δ-セレノリシンを導入したユビキチン化を受ける側のタンパク質とのセレン同士の化学選択的縮合反応を新規に開発する。この新規リシン残基修飾法は、タンパク質のユビキチン化のみならず薬剤などの低分子によるタンパク質の修飾法ともなると期待される。本年度は、Boc固相合成法を用いてδ-セレノリシンを導入したタンパク質を合成するためにBoc基で保護されたδ-セレノリシン誘導体の合成法を確立した（課題１）。また、ユビキチン-α-セレノエステルの合成の基礎となるC末端活性化ユビキチンの効率的な合成法を確立した。この際、固相合成でのアミノ酸の縮合反応に超音波を用いることで縮合時間を短縮した（課題２）。さらに、セレノラクトンを利用した連結反応の前段階としてチオラクトンを用いたペプチド連結反応を検討した（課題２）。これらの研究成果について国際学会１件を含む4件の学会発表を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究の目的は、不要タンパク質の分解、DNA修復、炎症、アポトーシスなど多彩な生命現象に関わっているタンパク質のユビキチン化の機能解明のためのプローブとなるユビキチン化タンパク質の効率的な合成法の開発である。タンパク質には反応点となるカルボキシ基とアミノ基が多数存在するため、プローブを短工程で効率的に合成するためには選択的縮合反応の開発が必要である。我々は、セレンの高い反応性に着目し、Brikらの報告しているδ-メルカプトリシンの硫黄原子をセレン原子に置換したδ-セレノリシンを介したペプチドチオエステルとの連結反応を新たに開発した。本研究ではその反応を発展させ、ペプチドセレノエステルを利用することで、δ-セレノリシンを導入したユビキチン化を受ける側のタンパク質とのセレン同士の化学選択的縮合反応を新規に開発し、タンパク質のユビキチン化のみならず薬剤などの低分子による効率的なタンパク質のリシン残基修飾法を確立する。設定した３つの課題の進行状況：課題１では、Boc固相合成法を用いてδ-セレノリシンを導入したタンパク質を合成するためにBoc基で保護されたδ-セレノリシン誘導体を合成した。課題２では、C末端活性化ユビキチンの２セグメント戦略による合成法を確立した。この際、固相合成でのアミノ酸の縮合反応に超音波を用いることで縮合時間を短縮し、効率的に長鎖ペプチドセグメントが合成できるようになった。さらに、セレノラクトンを利用した連結反応の前段階としてチオラクトンを用いたペプチド連結反応を検討し、チオラクトンの合成条件に関する知見と連結反応が進行することを見出した。これらの研究成果について国際学会１件を含む4件の学会発表を行った。新規ユビキチン化反応開発の基礎となる課題１と課題２について順調に進んでいるため、進捗状況をおおむね順調と自己評価した。
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| 今後の研究の推進方策 |
我々は、セレンの高い反応性に着目し、Brikらの報告しているδ-メルカプトリシンの硫黄原子をセレン原子に置換したδ-セレノリシンを介したペプチドチオエステルとの連結反応を新たに開発した。本研究では、この連結反応を発展させてより効率的なユビキチン化タンパク質の合成法とするため、ペプチドセレノエステルとδ-セレノリシンを導入したユビキチン化を受ける側のタンパク質とのセレン同士の親和性を利用した化学選択的縮合反応の研究を進めている。現在の進捗状況は、設定した３つの課題のうち、課題１では、Boc固相合成法を用いてδ-セレノリシンを導入したタンパク質を合成するためにBoc基で保護されたδ-セレノリシン誘導体を合成した。今後は、Boc-δ-セレノリシン誘導体を利用した固相合成を検討する。課題２では、超音波を利用した縮合反応を用いてC末端活性化ユビキチンの２セグメント戦略による迅速な合成法を確立した。さらに、チオラクトンを用いたペプチド連結反応を検討し、チオラクトンの合成条件に関する知見と連結反応が進行することを見出した。今後は、ユビキチン-セレノラクトンの合成法の検討を中心に研究を進める。ユビキチンの２セグメント合成戦略ではシステインを利用したNCL法による合成を行っているが、セレノシステインを介した連結法を利用してセレノシステイン含有ユビキチンポリペプチドを合成し、セレノラクトンへの変換を検討する。まず、チオラクトンの連結反応の検討に利用した40残基の比較的短鎖のタンパク質でセレノラクトンの合成反応を検討する。セレンは硫黄に比べて非常に酸化されやすく扱いにくい化合物であるが、これまでのδ-セレノリシン誘導体の取り扱いで得たノウハウを利用してセレノラクトンの合成条件を確立する。そして、76残基の長鎖のユビキチンのセレノラクトンの合成に応用する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度の研究はおおむね順調に進行しているが、次年度使用額が生じた主な理由は、コロナ禍で学会発表がオンラインとなったため旅費として計上していた額が使用されなかったためである。次年度以降に学会が対面形式で開催されるようになれば、成果発表と情報収集・交換を行うために旅費を利用して学会に参加したいと考えている。また、本年度はBoc-δ-セレノリシン誘導体の合成やユビキチンペプチドセグメントの固相合成を条件検討のための比較的小スケールで行った。次年度は合成スケールを拡大するため、必要な試薬量や分取用HPLCカラムの購入などにも使用していく予定である。さらに、本年度は質量分析装置やHPLCの故障もなく順調に研究が進行したので幸いであったが、次年度以降の予定外の修理費などにも対応できるように次年度以降に助成金を有効利用していきたい。
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