| 研究課題/領域番号 |
21K05317
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
桑原 正靖 日本大学, 文理学部, 教授 (40334130)
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| 研究分担者 |
藤田 博仁 日本大学, 文理学部, 助手 (60822244)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | miRNA / バイオマーカー / イメージング / 等温遺伝子増幅法 / Point of Care Testing |
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| 研究実績の概要 |
本法ではこれまでにｍＲＮＡの特異的検出系の開発を行ってきたがｍＲＮＡとは異なり、ｍｉＲＮＡは２０ｍｅｒ程度の短鎖であるため、増幅反応における開始複合体の形態を最近接塩基対パラメータ（ｎｅａｒｅｓｔ ｎｅｉｇｈｂｏｒ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）を用いた核酸の安定性予測に基づき種々検討した。ｍｉＲＮＡ標的の検出系では、標的のヌクレオチド鎖と検出試薬のひとつである捕捉ヌクレオチド鎖との解離・結合によるターンオーバーがないため、検出感度は概して長鎖のｍＲＮＡ標的よりも劣ることが当初より分かっていた。しかし、本研究において、シグナル増幅をもたらすポリメラーゼ反応による増幅配列の最適化を行ったり、φ２９ＤＮＡポリメラーゼやＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼなど用いる酵素やその組み合わせ等を変更したりすることにより反応効率を高めることができ、当該問題について解決の目途が付けられた。さらに、配列が異なる複数の標的を同時に検出するための蛍光プローブであるチオフラビンT誘導体やマラカイトグリーン等の誘導体を新たに得ることができた。マラカイトグリーンは発光波長がチオフラビンＴよりも長波長にあり（λｅｍ ＝ ６３０ｎｍ）、従来、核酸プローブとして使用されてきたが、疎水性が高く非特異的な吸着等の問題があった。本研究では、エチレングリコール鎖等の導入により親水性を高めた誘導体を設計・合成することができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
各種ＤＮＡポリメラーゼ等を検討したことに加え、増幅配列の再構築を行ったことにより、感度向上が確認され、プローブの種類も増やすことができたため。φ２９ＤＮＡポリメラーゼおよびＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼについては、市販の同族のものあっても、いくつか遺伝子工学的に改変を加えたものが幾種かあり、また、自作したＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼについては、３’ー＞５’エキソヌクレアーゼ活性を低減させたものなど幾種かについて検証を行うことができた。プローブについては、蛍光発光波長が従来のものとは異なるものを得ることができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後、癌関連マーカーとして知られるｍｉＲＮＡ－２１０やｍｉＲＮＡ－１５５等のｍｉＲＮＡについて定量検出系を構築し、夾雑物を含む実サンプルを用いた最適化を行う。また、複数種の標的ｍｉＲＮＡの同時検出のための蛍光プローブについても追加して設計合成を行う。さらに、検出反応・増幅反応における夾雑物の影響等について、系統的な検証を行なうとともに、デタージェントの添加等によるバックグランド発光の低減効果等について、蛍光顕微鏡を用いて検討を行う。さらに経時測定を行う予定であるため、プローブの退色についても検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
検出系検証のためのオリゴヌクレオチドが予想よりも少なく済んだ。次年度は、条件を精査するために、より多くの配列の異なるオリゴヌクレオチドを使用する予定である。また、これに伴い、ＤＮＡポリメラーゼやヌクレオシド三リン酸等の使用も大幅に増加する見込みである。ヌクレオシド三リン酸については、副反応の低減のため、高純度でフレッシュなものを要することが分かっている。そのため、割高ではあるが少量のものを購入して使用する予定である。
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