| 研究課題/領域番号 |
21K05329
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| 研究機関 | 酪農学園大学 |
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研究代表者 |
小八重 善裕 酪農学園大学, 農食環境学群, 准教授 (60456598)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 菌根共生 |
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| 研究実績の概要 |
菌根の崩壊ステージにおける共生の分子細胞メカニズムに着目している本研究では、まず根全体から崩壊ステージの共生部位を他のステージと区別して単離・解析することを可能にする実験系の構築を行った。菌根の共生ステージマーカーであるGFP-SCAMP組み換えイネを用いて、AM菌が感染している3-5 mmの根を蛍光実体顕微鏡下で切り出し、RNA抽出方法の異なる複数の抽出キットを用いて、RT-PCRがもっとも成功する条件を検討した。破砕・圧搾・回収・濃縮方法などを条件を変えて繰り返し検討し、マッハライ・ナーゲル社のNucleoSpin RNA XSを用いて、菌根特異的リン酸トランスポーターPT11遺伝子と、内部コントロールとして、イネアクチン遺伝子のRNAを、ほぼ100％の確率でRT-PCR増幅することに成功した。これまでは、数本の根断片をまとめてRNAを抽出し、同遺伝子のRT-PCR増幅をおおよそ50％の確立で成功していたが、今年度の成果では、一つの根の断片から（一つのAM菌の感染部位から）の解析が可能になった点において、大きな前進があった。
本研究では共生ステージとして、初期、中期、後期に区別したサンプリングを目指す。GFP-SCAMPを指標に、AM菌は感染しているが共生が未熟で養分交換器官である樹枝状体をほとんど含まない根の断片からも、樹枝状体を含む細胞で強く発現するPT11遺伝子をRT-PCRで増幅できていることから、現在の方法において、かなり発現レベルの低い遺伝子についてもその解析が可能になったと考えられる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
共生ステージのマーカーとして、発達期にあたるPT11遺伝子のRT-PCR増幅には成功したが、崩壊ステージにあたると予想していた複数の遺伝子の発現が発達期にも認められており、当初2022年度に計画していた崩壊ステージのRNAseq解析を、年度初めから進められる段階ではないことから、研究はやや遅れているといえる。
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| 今後の研究の推進方策 |
共生ステージのマーカーとして、GFP-SCAMPを用いるだけでは、発達ステージと崩壊ステージを効率よく識別・分離できない可能性がでてきた。申請者はすでに、もう一つの共生ステージマーカーとして、PT11プロモーター(pPT11)の制御化でFluorescent Timer（タンパク質合成から時間経過とともに緑から赤へと蛍光色調が変化する）タンパク質を発現させる組み換えイネを作出しており（未発表）、これを用いることで、崩壊ステージの絞り込みと、引き続き崩壊ステージマーカー遺伝子のRT-PCRおよびその特定を行う。研究開始時の2021年度に比べると、共生の崩壊ステージに関わると予想される遺伝子の知見も増えている。またマッハライ・ナーゲル社の微量サンプルからのRNA抽出キットのラインナップも増えており、RNA抽出効率もさらに改善できると期待している。既存の知見のみから、RT-PCRで崩壊ステージの特定が困難な場合は、共生ステージをGFP-SCAMPとpPT11-Fluorescent Timer形質転換体の菌根感染の形態的情報から明確に区別したうえで、さらに効率を高めて抽出したRNAサンプルを用い、RNAseq解析に進むことを検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究の進捗が遅れ気味であり、その未履行の実験に支出する予定だった費用が残額となっている。次年度実験を実施しそこで支出する予定である。
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