| 研究課題/領域番号 |
21K05337
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| 研究機関 | 信州大学 |
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研究代表者 |
池田 正人 信州大学, 学術研究院農学系, 教授 (00377649)
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| 研究分担者 |
竹野 誠記 信州大学, 学術研究院農学系, 准教授 (30422702)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | コリネバクテリウム グルタミカム / ビオチン排出輸送体 / ビオチン取り込み輸送体 |
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| 研究実績の概要 |
【BioE欠損候補株の選抜法】想定される未同定のビオチン排出輸送体（BioEと命名）の欠損候補株を選抜するための構想は以下の通り。コリネ型ビオチン生産菌はビオチン取り込み輸送体BioYを破壊すると、ビオチンを自ら合成できるのにビオチン要求性となる。このBioY破壊株（DD1株と命名）から再びビオチン非要求性になったサプレッサー株を選抜する。BioE欠損株に想定される表現型は次の3点。① 生育にビオチンを要求しない ② ビオチンを分泌しないか分泌量が低下している ③ 細胞内に高濃度のビオチンが蓄積している。
【BioE欠損候補株の取得】DD1株から変異処理にて上記3要件を満たす候補株を1株（#499株）見出した。全ゲノム解析で#499株に計80個の変異を見出す。その内、以下の4変異を有力候補として選抜。① Cgl0406：[Pro822Ser] ABC transporter, permease component ② Cgl0859：[Ala307Val] Hypothetical membrane protein ③ Cgl0946：[Gly88Asp] ABC transporter, ATPase component ④ Cgl2657：[Gly70Asp] Transcriptional regulator, Cgl2656 (LysE-type translocator)のActivator
【相補試験】上記4種の野生型遺伝子をクローン化。各プラスミドを#499株に導入し相補試験を実施。もし目的遺伝子であれば、親株#499株の表現型（ビオチン要求性）に戻るはずであるが、いずれも回復能を示さなかった。従って、いずれも目的遺伝子ではないと判断された。原因変異を抽出する段階で目的変異を見逃している可能性があるため、今後は自然変異によって目的候補株の取得を試みる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
上記3要件を満たす候補株を1株（#499株）取得し、同株のゲノムに導入されている変異を全て同定した。計80個の変異の内訳は、遺伝子内が62個、遺伝子間が18個で、遺伝子内変異62個の内、トランスポーターまたは膜酵素とアノテートされている変異は8個であった。その内、4変異が有力候補と考えられたため、野生型遺伝子による相補試験を行ったが、最終的にいずれも目的遺伝子ではないと判断された。
従って、選抜方法の修正が必要と判断されるため。
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| 今後の研究の推進方策 |
変異処理法では多数の変異の中から原因変異を抽出する段階で目的変異を見逃す可能性がある。従って、今後は自然変異によって目的候補株の取得を試みる。目的候補株が得られたら、親株との比較ゲノム解析を行い、原因変異を特定する。
原因変異が目的のbioE変異であれば、発酵への応用と生物界におけるホモログの同定を行う。もし、原因変異が予想外の新規変異であれば、その変異がなぜBioE欠損株に想定される表現型を示すのかを考察する。同時に、本選抜法にて目的のbioE変異が得られない理由があるとしたらそれは何かを吟味する。
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| 備考 |
研究者総覧 池田正人 http://soar-rd.shinshu-u.ac.jp/profile/ja.uhLNPUkh.html
Researchmap 池田正人 https://researchmap.jp/read0131716
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