| 研究課題/領域番号 |
21K05343
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| 研究機関 | 山口大学 |
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研究代表者 |
高坂 智之 山口大学, 大学研究推進機構, 准教授 (70500453)
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| 研究分担者 |
松谷 峰之介 東京農業大学, その他部局等, 准教授 (70380558)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 異種発現 / ゲノム情報 / 大腸菌 / 成熟化因子 / プロピオン酸酸化細菌 / コハク酸脱水素酵素 / ヒドロゲナーゼ / 膜タンパク質 |
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| 研究実績の概要 |
最終年度：1) ゲノム情報を基にした成熟化候補遺伝子の選抜：遺伝子の分子系統とその関連遺伝子の保存性の可視化により特定の遺伝子の機能化に必要な遺伝子群を明らかにできることから、遺伝子の分子系統解析を計算機により実施する方法の検討とその自動化を試みた。検討により、計算機での自動化手法をある程度構築できたことから、遺伝子の分子系統解析を手動ではなく自動的に実施することを可能にした。
2) 成熟化候補遺伝子群の機能解析：プロピオン酸酸化細菌由来で大腸菌ヒドロゲナーゼの成熟化を補完できる遺伝子はエンドペプチダーゼhyaDのみである状況は改善できなかった。主な原因として、大腸菌の成熟化遺伝子に細胞毒性が出る場合が多かったことから、発現の調節が重要であることを示唆した。
3) 成熟化が必要な酵素の機能化：グラム陽性菌由来コハク酸脱水素酵素の大腸菌での異種発現とその解析により、膜タンパク質が発現しやすい大腸菌株に変更し、フラボプロテイン、Fe-Sクラスター、そして膜サブユニットを同時に発現させることで機能化した複合体が形成される可能性を示唆した。一方、フラビンアデニンヌクレオチドのフラボプロテインへの結合は、枯草菌由来の精製サブユニットを用いたin vitroアッセイにより、全てのサブユニット存在下で起ることを示した。
全体の成果：ゲノム情報から関連遺伝子群を可視化することが可能であり、遺伝子の機能化に関与する未知遺伝子を見出せることを示唆した。成熟化遺伝子の機能解析は多数は行えなかったが、大腸菌においてプロピオン酸酸化細菌由来エンドペプチダーゼの機能は示すことが出来、手法改善による機能解析の可能性を示唆した。そして、大腸菌で活性が見られない異種タンパク質の解析により、大腸菌での発現を改善する必要があること、そしてゲノム解析情報から機能化に必要な遺伝子を選択可能であることを示唆した。
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