| 研究実績の概要 |
非天然のヒドラジド化合物を唯一の炭素源として生育可能なMicrobacterium hydrocarbonoxydansにおいてhydrazidaseとABCトランスポーターを含むオペロンが重要な役割を果たしている。
昨年度に引き続き、トランスポーターの大腸菌での発現、in vitroでの発現系構築を試みたが、発現量が非常に低く、かつ、断片化されている可能性が観察され、現在に至るまで解析用の蛋白質量を得るに至っていない。
トランスポーターの発現系構築と並行して、hydrazidaseの天然の基質がパラベンであるという前提のもと、さらなる検証を行った。メチル、プロピル、ブチルパラベンの3つの基質を用いて、hydrazidaseのkinetics解析を行い、kcat, Kmの値からこれらが酵素基質となることが示された。
Hydrazidaseはamidaseファミリー酵素であるが、4-hydroxyphenyl構造が基質特異性を決める構造であることが結晶解析から明らかとなっている。このhydrazidase、ABCトランスポーターを含め、相同なオペロンをもつ放線菌をデータベースより見出している。そのうちの一つPseudonocardia acaciaeからamidase(PaAm)をクローニングし、メチル、プロピル、ブチルパラベンを用いてkinetics解析を行った。kcat, Km値をhydrazidaseと比較すると、パラベンへの指向とHBPHへの指向に差が見られた。昨年度、PaAmの構造解析に成功していたものの、引き続き3 Aからの分解能改善を試みたが、果たせなかった。HydrazidaseとPaAmの立体構造を比較したところ、活性部位入口に位置するループ構造部位に差があり、これがパラベンとHBPHへの基質の指向性に影響を与えていると考えられた。
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