| 研究課題/領域番号 |
21K05356
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| 研究機関 | 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構 |
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研究代表者 |
佐藤 勝也 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 高崎量子応用研究所 放射線生物応用研究部, 上席研究員 (90370402)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 放射線抵抗性細菌 / デイノコッカス・ラジオデュランス / DNA損傷応答機構 / DNA修復機構 / PprIタンパク質 / DdrOタンパク質 / Mn / 環状ヌクレオチド |
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| 研究実績の概要 |
放射線抵抗性細菌デイノコッカス・ラジオデュランスの高いDNA修復能力を担うDNA損傷応答機構において、制御因子であるPprIタンパク質のメタロプロテアーゼ活性により、DdrOリプレッサータンパク質は切断され、DNA修復関連遺伝子群が発現誘導される。そこで、PprIタンパク質DdrOタンパク質との相互作用を解析するために、DdrOリプレッサータンパク質に対する抗体を作製した。具体的には、ラジオデュランスのddrO遺伝子配列をPCR増幅後、N末端にHisタグを含む遺伝子発現用プラスミドpET-16bに連結し、ddrO遺伝子発現プラスミドを作製した。得られた発現プラスミドを大腸菌BL21（DE3）株に導入し、IPTG誘導によるDdrOタンパク質の大量発現系を構築した。大腸菌内で発現させたDdrOタンパク質は、Hisアフィニティカラムを用いて精製し、抗原としてウサギ1羽に免役することで、DdrOタンパク質に対するポリクローナル抗体を作製した。また、PprIタンパク質の活性化に関連が示唆されるMn及び環状ヌクレオチドの細胞内量を改変するため、修復シグナル欠損変異株の作製に着手した。具体的には、細胞内へのMnの輸送及び細胞外への排出に係わるタンパク質をコードする遺伝子群（mntA及びmntH）、及び環状ヌクレオチドの生合成に関連するタンパク質をコードする遺伝子群（dacA、fimA及びdosC）を薬剤耐性遺伝子と置換することで、修復シグナル欠損変異株を作製している。具体的には、目的遺伝子の上流及び下流の領域（600から800bp）をそれぞれPCR増幅した各DNA断片で薬剤耐性遺伝子カセットを連結することで遺伝子欠損用DNA断片を作製した。得られたDNA断片を用いてラジオデュランスの野生株を形質転換し、修復シグナル欠損変異株を作製した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の計画通り、PprIタンパク質活性化の指標として、細動内DdrO発現量の変動を解析する実験系を構築するための、DdrOリプレッサータンパク質に対するポリクローナル抗体の作製、及び、修復シグナル欠損変異株を作製しており、おおむね順調に進展している。
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| 今後の研究の推進方策 |
作製した修復シグナル欠損変異株を用いて、DNA損傷後の細動内DdrO発現量の変動、及びルシフェラーゼ遺伝子発現を指標としたレポーターアッセイを実施することで、PprIタンパク質の活性化に与える影響について解析することで、デイノコッカス・ラジオデュランスのPprIタンパク質依存的DNA損傷応答機構の全容解明に向けた研究を推進する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
調達方法の工夫により経費が節約できたためであり、次年度の消耗品購入に使用する。
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