| 研究課題/領域番号 |
21K05369
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| 研究機関 | 東京農業大学 |
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研究代表者 |
梶川 揚申 東京農業大学, 応用生物科学部, 教授 (30646972)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | べん毛 / フラジェリン / 乳酸菌 / 運動性 / TLR5 |
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| 研究実績の概要 |
Ligilactobacillus agilisのべん毛タンパク質（フラジェリン）について、初年度は大腸菌に導入した組換えタンパク質を中心に検討を行い、仮説通り特定の３か所のアミノ酸変異が免疫学的活性に深く関わることが確認された。この結果を受け、これらのアミノ酸残基を置換した組換えL. agilisの作製に取り組んだ。あらかじめフラジェリン遺伝子（fliC2およびfliC1）を欠失した変異株にアミノ酸置換型フラジェリン遺伝子（fliC2QIR）を再導入することで組換え体を取得したが、この変異株はべん毛を形成せず、運動性を示さなかった。この組換え体にもう１コピーの野生型フラジェリン遺伝子（fliC1）を追加導入したところ、運動性を示した。べん毛を精製し、解析を行ったところ、当該組換え体はfliC2QIRとfliC1のヘテロポリマーであることが示唆された。この組換え体はTLR5を介した炎症誘導能が野生株よりも高いことが細胞実験により示された。また、マウスへの経口投与の結果、野生株を投与した場合と比較し、組換え体を投与した群では有意にべん毛特異的抗体産生誘導が促進されていた。これらの結果は、変異型フラジェリンの産生により当該組換え体の免疫原性が高くなっていることを示していた。また、この結果は本研究課題の「L. agilisはTLR5に認識されにくいフラジェリンを持っており、それが宿主との共生関係を築くうえで重要である」という仮説を支持するものであった。
L. agilisのフラジェリンは多重に糖鎖修飾を受けているが、この点についても宿主免疫系との相互作用に関わる可能性が考えられている。そこで、フラジェリン遺伝子周辺の推定糖転移酵素遺伝子について、それぞれ欠損変異株の取得を試みた。今後、これらの変異株を用いてフラジェリン糖鎖修飾への影響を調べる予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
L. agilisがもつフラジェリンタンパク質中の特定アミノ酸残基がTLR5による認識において重要であることを、大腸菌の組換えタンパク質およびL. agilisへの変異導入により確認する計画については順調に進み、論文投稿も終えることができた。フラジェリンの糖鎖修飾に関する実験については、野生株由来のフラジェリンに含まれる糖の質量分析を行い、いくつかの候補分子を見出すことができた。遺伝子欠損変異株の取得をほぼ完了することができたが、一部の変異株が産生するフラジェリンタンパク質の抽出が容易ではなく、今後の解析に遅れが出る懸念がある。また、一部の変異株についてはべん毛形成自体が観察されなくなることから、その遺伝子機能を明らかにすることは難しいと思われる。遺伝子組換え体や遺伝子欠損変異株の取得が進捗を左右するが、これについてはほぼ終えることができているため、全体としては概ね順調と思われる。
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| 今後の研究の推進方策 |
最終年度となるため、可能な限り研究成果をまとめられる形にできるような実験データの取得を目指す。糖鎖修飾がべん毛繊維およびフラジェリンにどのような影響を与えるかを調べることが主な仕事となる。具体的には糖転移酵素遺伝子欠損変異株の表現型を調べ、フラジェリンに含まれる糖鎖分子の解析を行う。また、各変異株由来のべん毛を精製し、糖鎖修飾がべん毛の安定性に与える影響を調べる。作製が可能であればフラジェリンのアミノ酸置換と糖鎖の欠失を同時に行った組換えL. agilisを作製し、動物実験によりその免疫原性を調べることで、それぞれの要因がL. agilisと宿主の共生関係に重要なものであることを示す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
概ね計画的に予算を執行できたが、一部の消耗品については国内在庫が無く、当該年度内に執行手続きを終えることができない可能性があったため、次年度に持ち越すこととした。
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