| 研究課題/領域番号 |
21K05376
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| 研究機関 | 防衛大学校(総合教育学群、人文社会科学群、応用科学群、電気情報学群及びシステム工学群) |
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研究代表者 |
平津 圭一郎 防衛大学校(総合教育学群、人文社会科学群、応用科学群、電気情報学群及びシステム工学群), 応用科学群, 准教授 (00294538)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | 転写 / プロモーター配列 / 高度好熱菌 / シグマ因子 / ショットガンスクリーニング |
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| 研究実績の概要 |
昨年度までに、Thermus thermophilus HB27株のゲノムショットガンライブラリーを全20個用いてプロモータースクリーニング実験を行い、合計571種類の高いプロモーター活性を示すクローンを単離した。ゲノム配列データを用いて各DNA断片が含む推定遺伝子（ORF）を確認すると、55クローンは転写対象のORFが存在しないので偽陽性と判断した。また、12クローンはCRISPR領域やtmRNAなど、プロモーター部位の推定が難しい機能性RNAを含むために解析対象から除外した。残りの504クローンのうち190クローンはそれぞれ異なるゲノム領域を含み、その他の314クローンは複数が重複して111種類のORF上流領域を含んでいた。この重複クローンは、1つのORFに対して異なる断片長DNAがプロモーター活性を示したので、偽陽性の可能性が低い最も信頼性の高い陽性クローンと考えられた。そこで111種類のORF上流のDNA塩基配列解析によりプロモーター配列を推定すると、110種類がσ70型のプロモーター認識共通配列と類似の塩基配列を含んでいた。また、推定プロモーターの中には、転写対象またはその上流のORF内に位置する例が多数見つかった。
今年度は、111種類の各重複クローンのうち、2個以上のORF上流を含む19種類の各DNA領域を実験的にさらに絞り込むことで、解析対象のORFおよびそのプロモーター領域を確定した。このデータを加えて111種類の推定プロモーター配列を解析した結果、もっとも出現頻度の高い塩基配列は、-35領域では5’-TTGACA-3’で、既報のσ70型の共通認識配列と同じだったが、-10領域では5’-TATACT-3’が各位置の最頻出塩基であり、既報の5’-TATAAT-3’とは異なっていた。また、σ70型のプロモーター認識を促進するextended -10 elementが46種類のプロモーターに存在しており、これが同菌の高いプロモーター活性における重要な要素と示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
これまでに、平均長0.75 kbpのゲノムDNA断片をレポータープラスミドに挿入したゲノムショットガンライブラリーを全20個用いてプロモータースクリーニング実験を行い、合計571種類の高いプロモーター活性を示すクローンを単離した。これはThermus thermophilus HB27株の約2 Mbpのゲノムを双方向にカバーする場合（カバー率 = 1）の約5.6倍に相当し、当初の本実験計画全体のスクリーニングの目安であるカバー率 = 3を大幅に上回った。偽陽性等を除いた504クローンのうち、314クローンは複数が重複して111種類のORF上流領域を含んでおり、偽陽性の可能性が低い最も信頼性の高い陽性クローンと考えられた。
今年度は、各重複クローンのうち、2個以上のORF上流を含む19種類の各DNA領域をさらに絞り込んで、解析対象のORFおよびそのプロモーター領域を確定した。その結果、昨年度までに明らかになっていた、１つを除く110種類の推定プロモーター配列がσ70型の認識共通配列と高い類似性を有する特徴に加えて、Thermus属では転写促進効果がin vitro実験においてのみ報告されている extended -10 elementおよびGGGA motifを含むプロモーターが多数含まれている事が明らかになった。
本研究の目的は、T. thermophilus特有のプロモーター構造、ゲノム構造の実態を解明し、ゲノム情報を高度に活用するための知的情報基盤の構築へと繋げることである。現在までにスクリーニング実験を当初計画の約2倍のゲノムカバー率 = 5.6相当を実施し、得られた111種類の重複クローンのプロモーター配列を推定してその特徴の細分化を実施しており、上記に示す進捗状況の区分と判断をした。
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| 今後の研究の推進方策 |
既に3年間の実験により、既存の約1500クローンから成る全20個のライブラリーすべてのスクリーニングを終了した。その結果、偽陽性等の解析対象外クローンを除く504クローンはそれぞれ異なるゲノム領域を含む190クローンと、314クローンの複数が重複して111種類のORF上流領域を含むグループに分類された。1つのORFに対して、ゲノムDNAの断片長および切断部位が異なっても高いプロモーター活性を示す重複クローンは最も信頼性の高い陽性クローンと考えられるため、推定した111種類のORF上流領域のプロモーター配列の特徴を明らかにすることによりT. thermophilus特有のプロモーター構造、ゲノム構造の実態解明を試みる。今後は以下の計画で研究を進めていく。
「令和6年度」： 2種類以上の重複したクローンが存在する111種類のうち、σ70型のプロモーター認識共通配列が存在する110種類のプロモーター配列の塩基配列を特徴ごとに細分化したグループに分類し、T. thermophilus特有のプロモーターと遺伝子の構造の解明を行う。具体的にはプロモーター認識共通配列である-35領域と-10領域の塩基配列の特徴に加えて、これらの認識部位とextended -10 elementやGGGA motifなどの転写を促進する配列の有無との関係や、ORFがコードする遺伝子の機能とプロモーターの特徴との関連性の解明を試みる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当該年度の実験は、19種類クローンに対しての各DNA領域の欠失実験や変異導入実験などの、適宜結果を見ながら追加実験の判断が必要となる見積もりが困難な実験であった。そのために、当初の計画より短時間で結果が出せたことや、前年度に購入した試薬類の使用により、結果として次年度使用額が生じた。また、論文作成と投稿・掲載に必要な費用を見込んでいたが、当該年度内に間に合わなかったために次年度使用額が生じた。今年度も引き続き実験を伴うプロモーター配列の機能解析を行うと共に、論文執筆および投稿を行う予定であり、使用計画は従来通りで変更の必要はない。
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