研究課題
栄養豊富条件における液胞へのアミノ酸集積メカニズムと、液胞を起点とするアミノ酸応答シグナルの解明に向け、本年度はVsb1の輸送活性について単離液胞膜小胞を用いた生化学的解析を行うとともに、Vsb1相互作用因子同定のための実験系構築を進めた。酵母の液胞は遊離アミノ酸を蓄積する巨大な細胞内貯蔵庫である。我々は液胞内に特に多量に存在する塩基性アミノ酸の蓄積に関して、出芽酵母Vsb1が主要な役割を果たすことを明らかにしている。今回、分裂酵母Vsb1ホモログとしてSPAC24H6.11c(vsb1+)を見出し、その機能解析を行った。GFP融合型Vsb1pが分裂酵母液胞膜に局在したことから、本遺伝子産物が新規液胞膜タンパク質であることを示した。分裂酵母vsb1+遺伝子の単一破壊により液胞内塩基性アミノ酸量が顕著に減少した一方で、酸性および中性アミノ酸量はほとんど変化しなかったことから、出芽酵母VSB1と同様に液胞への塩基性アミノ酸蓄積に関与する遺伝子であることが示唆された。液胞膜小胞単離のために出芽酵母でvsb1+を発現させたが、Vsb1pが液胞膜に局在しなかったため、分裂酵母Vsb1pのアミノ酸輸送活性の生化学的評価は不可能だった。今後の輸送活性解析には精製再構成系の構築が必須である。出芽酵母Vsb1と分裂酵母Vsb1pは推定膜貫通領域において特に保存性が高い。推定第一膜貫通領域内に保存されたアスパラギン酸残基のアラニン置換変異体（vsb1D174A）発現株においては、液胞内塩基性アミノ酸量が著しく減少したことから、分裂酵母Vsb1pのD174残基が活性に関わる重要アミノ酸残基であることを示した。VSB1ホモログは酵母だけでなく担子菌や不完全菌にも広く分布することが分かってきた。液胞への塩基性アミノ酸蓄積はこれら真核微生物に共通する重要な生理的役割を担っていると考えられる。
2: おおむね順調に進展している
出芽酵母塩基性アミノ酸蓄積に関わるYGR125w（Vsb1）に関して、単離液胞膜小胞を用いた輸送活性解析によりアルギニン輸送活性を検出し、基質特異性を評価できた。しかし分裂酵母Vsb1pとの輸送活性比較を行うためにも、バキュロウイルス等を利用した発現精製系および再構成系構築を進める必要がある。出芽酵母Vsb1の長いN末端／C末端親水性領域については、活性調節などに関与する相互作用因子特定に向けた標識化タグ挿入箇所の探索を行った。現在のところ、30%程度の活性を保持した標識化タグ挿入型Vsb1を構築できている。これをもとに相互作用タンパク質の標識および質量分析法によるタンパク質同定を行い、Vsb1の活性調節因子特定を試みる。親水性領域変異型Vsb1の作製を進める中で、興味深いことにN末端一部欠失型Vsb1が液胞膜に局在可能であること、N末端／C末端領域いずれもその完全欠失によりVsb1活性が著しく低下することを示唆する結果を得た。立体的構造も含め、これら親水性領域の役割についても今後解明する必要がある。
次年度は栄養応答シグナルにおける液胞内アミノ酸および液胞アミノ酸トランスポーターの関与について、野生株、ygr125wΔ株、およびavt1Δ株のマイクロアレイ解析を進め、栄養条件による遺伝子発現変動の比較により液胞アミノ酸トランスポーター下流でアミノ酸応答シグナルに関わる遺伝子群を特定する。今年度構築した標識化タグ挿入型Vsb1については、これを利用してVsb1の相互作用因子を特定するとともに、その栄養条件による変化を明らかにする。Avt1についても同様にタグ挿入および相互作用因子特定を進める。さらに特定された相互作用因子について遺伝子破壊株を作製し、液胞へのアミノ酸蓄積に及ぼす影響を調べる。またVSB1／AVT1それぞれの遺伝子破壊株について、Sch9リン酸化やGFP-Atg8プロセシングの検出等により、アミノ酸取込み系トランスポーターがTORC1活性およびオートファジーへ与える影響を調べ、アミノ酸／飢餓応答への関与を明らかにする。これらと同時にVSB1およびAVT1のバキュロウイルス発現・精製系を構築し、輸送活性の生化学的解析を進め、トランスポーターとしての性質を明らかにする。
少額のため次年度に合わせて物品購入に充てることにした
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Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry
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