祖先型L-アミノ酸酸化酵素を軸とするD-アミノ酸誘導体の大量生産に向けた基盤構築

2022 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 21K05395
• 研究機関: 静岡県立大学
• 研究代表者: 中野 祥吾 静岡県立大学, 食品栄養科学部, 准教授 (80748541)
• 研究期間 (年度): 2021-04-01 – 2024-03-31
• キーワード: X線結晶構造解析 / L-アミノ酸酸化酵素 / 祖先型設計

研究実績の概要

2021年度に取得したHTAncLAAOの立体構造を決定することを目的に、結晶化スクリーニングを行った。しかし良好な分解能を与える結晶を得ることができなかった。そこで配列データベースを再度探索し、HTAncLAAOと同様に活性を有し、かつ結晶性に優れたホモログ配列の取得を行なった。結果、4種類のFlavobacterium属の細菌からHTAncLAAO活性を有するホモログ配列を同定することができた。同定した4配列を用いて祖先型設計を行い、HTAncLAAOと約80%の配列相同性を有するHTAncLAAO2をデザインした。HTAncLAAO2について結晶化スクリーニングを行なったところ、2.2Å;分解能にてX線回折データを取得することに成功した。現在AlphaFold2で復元したHTAncLAAO2のモデル構造を鋳型とし、分子置換法にて位相決定を進めている。また酵素探索を進める中で副次的に取得した新規L-Lysine α-oxidaseについても構造機能解析を進め、論文として発表した (ACS Omega, 2022, 7(48): 44407-44419)。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

当初の目的の通り研究は進展している。特に本年度はHTAncLAAO2の取得とX線回折データの取得に成功し、本酵素の立体構造決定につながる重要な成果を得ることができた。また本研究を進める過程で得られた数多くの成果について、論文として出版することができている。

今後の研究の推進方策

HTAncLAAO2の位相決定と構造精密化を継続して実施する。構造決定後は本酵素の基質認識部位に部位特異的変異を導入し、反応性が低かったL-Trp誘導体やPhenylglycineへの活性獲得を目指した実験を行う。

研究成果

• [雑誌論文] Ligand Screening System for the RXRα Heterodimer Using the Fluorescence RXR Agonist CU-6PMN (2023)
  • 著者名/発表者名: Kawasaki Mayu、Motoyama Tomoharu、Yamada Shoya、Watanabe Masaki、Fujihara Michiko、Kambe Akira、Nakano Shogo、Kakuta Hiroki、Ito Sohei
  • 雑誌名: ACS Medicinal Chemistry Letters 巻: 14 ページ: 291～296
  • DOI: 10.1021/acsmedchemlett.2c00509
  • 査読あり
• [雑誌論文] Dynamical Interaction Analysis of Proteins by a Random Forest-Fragment Molecular Orbital (RF-FMO) Method and Application to Src Tyrosine Kinase (2023)
  • 著者名/発表者名: Yamamoto Yuta、Nakano Shogo、Shigeta Yasuteru
  • 雑誌名: Bulletin of the Chemical Society of Japan 巻: 96 ページ: 42～47
  • DOI: 10.1246/bcsj.20220304
  • 査読あり
• [雑誌論文] Reaction Mechanism of Ancestral <scp>l</scp>-Lys α-Oxidase from <i>Caulobacter</i> Species Studied by Biochemical, Structural, and Computational Analysis (2022)
  • 著者名/発表者名: Motoyama Tomoharu、Yamamoto Yuta、Ishida Chiharu、Hasebe Fumihito、Kawamura Yui、Shigeta Yasuteru、Ito Sohei、Nakano Shogo
  • 雑誌名: ACS Omega 巻: 7 ページ: 44407～44419
  • DOI: 10.1021/acsomega.2c06334
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Enzymatic Conjugation of Modified RNA Fragments by Ancestral RNA Ligase AncT4_2 (2022)
  • 著者名/発表者名: Kajimoto Shohei、Ohashi Miwa、Hagiwara Yusuke、Takahashi Daisuke、Mihara Yasuhiro、Motoyama Tomoharu、Ito Sohei、Nakano Shogo
  • 雑誌名: Applied and Environmental Microbiology 巻: 88 ページ: e01679-22
  • DOI: 10.1128/aem.01679-22
  • 査読あり
• [学会発表] 遺伝的アルゴリズムと立体構造を用いた高機能化酵素デザイン (2022)
  • 著者名/発表者名: 中野祥吾
  • 学会等名: 物性研短期研究会「理論タンパク質物性科学の最前線：理論と実験との密な協働」
  • 招待講演
• [学会発表] Development of genetic algorithm-based consensus protein design method to generate highly functional enzymes (2022)
  • 著者名/発表者名: Shogo Nakano
  • 学会等名: Active Enzyme Molecule 2022
  • 国際学会