| 研究課題/領域番号 |
21K05424
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| 研究機関 | 宮崎大学 |
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研究代表者 |
永濱 清子 宮崎大学, 農学部, 特任助教 (10510456)
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| 研究分担者 |
山森 一人 宮崎大学, 工学部, 教授 (50293395)
服部 秀美 宮崎大学, 農学部, 教授 (80508549)
榊原 陽一 宮崎大学, 農学部, 教授 (90295197)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 酸化ストレス / 機械学習 / 遺伝子発現制御 / プロテオーム解析 / クラスタリング |
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| 研究実績の概要 |
酸化ストレスは、生活習慣病などの様々な疾患への関与が指摘されている。生体内には酸化ストレスに対する防御機構が備わっているが、未発見なものも多く、その解明には既存の手法だけではなく、新しい視点からのアプローチが必要である。本研究では、独自の機械学習モデルの活用と遺伝子発現制御で培養細胞に新規機能性を人工的に付与する生化学実験を融合させた手法で、これまで発見されてこなかった新規酸化ストレス防御機構の探索・解明を目指すものである。
酸化ストレス防御能に関与する新規酸化ストレス防御機構を探索するため、抗酸化ストレス活性モデルの構築に使用した学習データとクラスターの異なる仮想タンパク質発現パターンを見出し、未知の酸化ストレス防御機構である可能性が想定される発現パターンの探索を試みたが、予測していたような結果がでなかった。
前年度に見出した候補となる複数のタンパク質発現パターンをHepG2細胞に再現するため、Hsp70などの6種類について発現用のプラスミドを作製した。Hsp70についてはHepG2細胞にトランスフェクションし安定発現細胞株を樹立した。作製したHsp70＋/HepG2細胞株は、moc/HepG2に比べ、過酸化水素による細胞増殖抑制を抑制し、酸化ストレスによる防御能が高かった。
抗酸化能を評価する新たな食品成分を探索するため、構築済みの抗酸化ストレス活性モデルにより評価した。その結果、抗酸化ストレス活性モデルで複数の魚類や畜産抽出物に高い抗酸化ストレス活性を有することを見出した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
酸化ストレス防御能に関与する新規酸化ストレス防御機構を探索するため、クラスタリングによる予測を試みた。構築済みの抗酸化ストレス活性モデル（人工ニューラルネットワーク）の学習データのうち、高活性のデータについてクラスタリングを行った。次に、仮想タンパク質発現パターンのうち、高活性を示したタンパク質発現パターン1,200データで学習データによるクラスタリングのいずれのクラスターにも属さない発現パターンを探索したが、上手くいかなかった。
前年度に見出した候補となる複数のタンパク質発現パターンをHepG2細胞に再現するため、Hsp70、TXNRD1などの6種類について発現用のプラスミドを作製した。Hsp70についてはHepG2細胞にトランスフェクションし安定発現細胞株を樹立した。液体クロマトグラフィータンデム質量分析（LC-MS/MS）とMRM（Multiple Reaction Monitoring）法を用いた定量法にてHsp70＋/HepG2細胞株とmoc/HepG2の発現量を分析したが、有意な差はなかった。しかし、Hsp70＋/HepG2細胞株は、moc/HepG2に比べ、過酸化水素による細胞増殖抑制を抑制し、酸化ストレスによる防御能が高かった。現在、クローニングを行い、Hsp70高発現株の取得を試みている。農学部の改修工事に伴い、実験の中断があったため、細胞株の作製が予定通りに進まなかった。
抗酸化ストレス活性を有する食品成分は、植物由来の2次代謝物が良く知られているが、動物由来のものは少ない。そこで、抗酸化能を評価する新たな食品成分を探索するため、構築済みの抗酸化ストレス活性モデルにより評価した。その結果、抗酸化ストレス活性モデルで複数の魚類や畜産抽出物に高い抗酸化ストレス活性を有することを見出した。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和4年度に取り入れたクラスタリングによる解析手法を再度検討し、抗酸化ストレス活性モデルの構築に使用した学習データとクラスターの異なる仮想タンパク質発現パターンを見出し、未知の酸化ストレス防御機構である可能性が想定される発現パターンを探索する。酸化ストレス防御機構に関与するタンパク質発現変動パターンの予測は、MRM法を用いた定量法にて収集したペプチドデータを基に新たに構築した抗酸化ストレス活性モデルも活用し次の候補となるタンパク質発現パターンの探索も行う。
令和4年度に作製したヒト肝がん由来HepG2細胞にHsp70を強発現させた安定発現株に、TXNRD1などの別の複数のターゲットとなる遺伝子を強発現または抑制させ、得られた安定発現株の遺伝子発現量やタンパク質発現量および機能発現の程度を評価する。酸化ストレス防御能の機能発現を確認できた安定発現株は、プロテオーム解析などを用いて新規酸化ストレス防御機構の探索を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
農学部の改修工事に伴い実験の中断を余儀なくされ、細胞株の作製が予定通りに進まなかった。そのため、安定発現株樹立後に実施予定であったプロテオーム解析や遺伝子発現解析などを実施することができなかった。次年度にプロテオーム解析や遺伝子発現解析などを行うため一部を繰り越しした。
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