| 研究課題/領域番号 |
21K05429
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
福島 英登 日本大学, 生物資源科学部, 教授 (60466307)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | リコンビナント・パラミオシン / イカ筋肉由来パラミオシン / イカ肉加熱品 / 筋肉タンパク質の分解 |
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| 研究実績の概要 |
前年度作製した、アカイカおよびアメリカオオアカイカのパラミオシン発現用大腸菌を用いて、リコンビナント・パラミオシン(rPm)の発現および精製条件を検討した。初めに発現用大腸菌をLB液体培地37℃で約2時間かけ対数増殖期まで振盪培養した。その後、①終濃度500μMのIPTGを添加し37℃で3h誘導、②終濃度500μMのIPTGを添加し25℃で24h誘導、③終濃度50μMのIPTGMを添加し20℃で96h誘導の3条件で発現誘導した。誘導後集菌した菌体を高イオン強度緩衝液中で超音波破砕し、遠心分離によりrPmを含む上清を得た。低イオンおよび高イオン強度緩衝液に対する透析と再溶解後に遠心分離に供しrPmを精製した。各精製工程で標品を採取し、SDS-PAGEによりrPmの精製度合いを確認した。この他に、SDS-PAGEによりイカ筋肉由来のパラミオシンとrPmを比較した。また、タンパク質比色定量であるBCA法によりタンパク質収量を調べた。
SDS-PAGEから①の条件では、rPmの発現は確認できたが、菌体破砕後、上清中にごく少量しか確認できなかった。すなわちこの条件では封入体が形成されrPmを回収することが困難であった。②および③の条件でもrPmの発現が確認できたが、③の菌体の方がrPmの発現量が多かった。以上の結果、本研究で構築したrPm発現系は、IPTG濃度を終濃度50μMに抑え、20℃の低温で96hという長時間の誘導が封入体の形成抑制に効果的であり、効率よくrPmを発現することが分かった。③の発現誘導後のタンパク質収量は800mlのLB液体培地に対して、アカイカrPmは12.1mg、アメリカオオアカイカrPmは16.2mgであった。今後は本手法で調製したrPmを用いて、動的粘弾性測定装置を用いた加熱ゲル形成過程の解析に取り組む。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
令和4年度に計画していた、前年度に作製したリコンビナント・パラミオシン(rPm)発現用の大腸菌pETシステムを用いた発現系を用いて、rPmの発現および精製工程を確立できた。またイカ肉からもnativeのパラミオシン精製工程も確立しており、おおむね当初の予定通り進捗できている。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和5年度は、前年度に大量調製したrPmおよびイカ肉より精製した筋肉由来のパラミオシンを用いて、動的粘弾性を指標とした加熱ゲル過程の分析に着手するなど、今後も予定通りに課題を進行する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
初年度（令和3年度）においてコロナ禍により、学会への参加や出張が制限されたことにより、次年度以降の使用額が生じた。令和5年度は学会への参加や出張を予定通り実施するとともに、rPmを用いた動的粘弾性測定、rPmをN末端より削ったshort rPm発現ベクターの作製および発現ベクターを用いたリコンビナントタンパク質の調製も併せて行う。
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