| 研究課題/領域番号 |
21K05530
|
|---|
| 研究機関 | 近畿大学 |
|---|
研究代表者 |
種坂 英次 近畿大学, 農学部, 教授 (80188391)
|
|---|
| 研究分担者 |
築山 拓司 近畿大学, 農学部, 准教授 (00423004)
白澤 健太 公益財団法人かずさDNA研究所, 先端研究開発部, 主任研究員 (60527026)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
|
| キーワード | エノキタケ / 子実体形成関連遺伝子 / 機能解析 / 過剰発現 / 遺伝子ターゲティング / 育種モデル菌 |
|---|
| 研究実績の概要 |
昨年度までに、エノキタケの子実体形成株（正常株n）および子実体形成不全株（変異株d3, d4, d5）について、フラスコ内での子実体形成系を構築した。また、RNA-seq解析から、正常株の子実体形成期に特異的に発現する2つの遺伝子、Fv.FDS（Flammulina development specific gene）およびハイドロフォビンFv.hyd1を子実体形成関連遺伝子として特定した。
2022年度はこれらの遺伝子の機能解析を目的として、FDS過剰発現株とノックアウト系統の作出を実施した。プロトプラスト-PEG法によって、変異株d3にFDS過剰発現カセットを導入した形質転換体Td3を作出した。Td3ではフラスコ内での子実体形成は観察できなかったものの、オガクズを含む菌床培地では正常株と同様に子実体を形成したことから、FDSは子実体形成に大きく関与する遺伝子であることを示した。一方、ノックアウト系統の作出においては遺伝子ターゲティング効率を減少させる非相同末端結合遺伝子の破壊に着手した。単核性発茸系統についてプロトプラスト-PEG法で非相同末端結合遺伝子Fv.LigIVの破壊用コンストラクトを導入した。形質転換後、ハイグロマイシンを含む選択培地に出現したコロニーを分離した。得られたFv.LigⅣ 破壊候補系統について、UV照射した菌糸体からRNAを抽出し、RT-PCRにてFv.LigⅣの発現確認を行った。その結果、一次スクリーニングで得られた904系統のうちの1系統においてFv.LigⅣ の破壊をゲノムレベルで確認するとともに、RT-PCRによりFv.LigⅣ 発現のノックアウトを確認した。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
RNA-seq,解析で得られた子実体形成関連遺伝子の機能解析として、① Fv.FDS過剰発現株の表現型解析を実施するとともに、② ノックアウト系統作出に向けて相同組換えを利用した遺伝子ターゲティングを実施し、非相同末端結合関連遺伝子Fv.LigIVの破壊系統を作出した。ここでの遺伝子ターゲティング頻度は約0.11％（1/904）であったことから、エノキタケは子嚢菌類のAspergillusやNeurosporaと同様に非相同末端結合をDNA修復の主要経路としていることを明らかにした。
|
| 今後の研究の推進方策 |
変異株d3で得られた形質転換体Fv.FDS過剰発現株の表現型（子実体形成のレスキュー）について、他の変異株de4, d5および単核性非発茸系統への導入を実施し、さらにFv.hyd1過剰発現株の解析も進める。一方、単核性発茸系統で得られたFv.LigIV破壊系統を用いて、Fv.FDSやFv.hyd1の遺伝子ターゲティングによるノックアウトと表現型解析を実施する。以上の結果から、子実体形成に関わる遺伝子群の相互の役割について検討する。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
当初目的であった子実体形成株群と形成不全株群の作出が滞っているが、現在、形成株15株と形成不全株22株が作出できている。令和5年度には、偶発的な自殖菌株群を含めてさらにそれぞれ数十株を作出し、RAD-seq解析に供する予定である。
|
