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ジーンターゲッティング（GT）は、相同組換え修復を介して標的遺伝子を望み通りに改変できる精密ゲノム編集技術であるが、高等植物においては効率向上が課題である。代表者のこれまでの研究において、PARP阻害剤処理や分割型Transferred DNA (T-DNA) によるGT鋳型配列のデリバリーがGT効率を向上させることを明らかにしてきた。本課題では、これら2つのアプローチによるGT効率向上のメカニズムを解明し、その知見から高効率GT系を確立することを目的とする。
イネのPARPタンパクは4つのホモログが存在するが、各タンパクの機能分化については明らかにされていない。本研究では、恒常的に発現しているOsPARP1とDNA損傷に対して著しく発現誘導されるOsPARP2Aの変異イネ系統を作出し、GT頻度低下の一因であるT-DNAのゲノムへのランダム挿入頻度を解析した。その結果、これらの変異体系統におけるT-DNA挿入頻度は野生株と変らなかった。また、野生型イネカルスにおけるPARP阻害剤3-MB処理も同様に、T-DNA挿入頻度に影響を及ぼさなかった。次に、相同組換え効率を評価するためのレポーターを導入したイネ系統を確立し、それらにおいて3-MB処理が相同組換え効率に及ぼす影響を解析したところ、3-MB処理によって相同組換え効率が僅かながら増加した。分割型T-DNAによる鋳型デリバリーがGT効率を向上させる機構を解明するため、分割型および一体型GTベクターを用いて作出したGT個体においてゲノムに挿入されている鋳型のコピー数をddPCRにより解析した。分離型ベクターは鋳型配列を載せたT-DNAがもう一方のT-DNAより高コピーでゲノムに挿入されていることが明らかとなり、分離型T-DNAでGT鋳型配列を高コピーでデリバリーできることを証明できた。
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