| 研究課題/領域番号 |
21K05591
|
|---|
| 研究機関 | 東北大学 |
|---|
研究代表者 |
宮下 脩平 東北大学, 農学研究科, 助教 (60556710)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
|
| キーワード | R遺伝子 / 抵抗性 / 細胞死 / 植物ウイルス |
|---|
| 研究実績の概要 |
１）異なるレベルの抵抗性を誘導するCMV変異体シリーズの整備
R遺伝子形質転換体Nicotiana benthamianaに全身壊死(全身HR, SHR)を引き起こす変異体を単離し、CPのT45M変異が原因であることを明らかにした。抵抗性誘導時の細胞間移行におけるMOIの低下は、HR誘導する野生型CPをもつCMVでは約30%なのに対し、この変異をもつCMVでは約13%と小さかった。この違いは両者の抵抗性誘導強度の違いを反映すると考えられた。一方CPのアルギニンリッチモチーフ（13-19番目のアミノ酸残基）の欠失変異体(CPdR)は高度抵抗性ERを誘導することが分かった。この領域のアラニン置換変異によりHRとERの中間的強度の抵抗性を誘導する変異体を複数得た。このうちmicroHRを誘導するものについては抵抗性誘導によるMOI低下が55%程度であることを明らかにした。これらにより、各変異体の抵抗性誘導強度をMOIで数値化して評価する系を確立するとともに、MOIを最終的な表現型とも関連付けることができた。
２）アグロインフェクションによる同期的抵抗性誘導系
アグロインフィルトレーションでCMV各分節をR遺伝子形質転換体N. benthamianaで合成させ、感染させて同期的に抵抗性誘導させる系の確立を試みた。CMV(Y)系統RNA1のcDNAを挿入したバイナリベクタは大腸菌毒性のため作製できたなったことから、RNA1, RNA2についてはCMV(TN)系統のcDNAを利用し、CMV(Y)系統由来RNA3 cDNAとともにアグロインフィルトレーションで導入した。その結果、野生型RNA3でインフィルトレート領域におけるHRを再現できた。CPdRではER誘導を期待したがHRとなった。そこでPVXベクタのアグロインフェクションでCPdRを発現させるとERとHRの中間的な表現型が観察された。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
（１）の異なるレベルの抵抗性を誘導するCMV変異体シリーズの整備では、高度抵抗性ERからERとHRの中間的表現型を示すもの、弱い抵抗性を示しSHRを誘導するものなど、多段階の抵抗性誘導レベルを示すCP変異体が得られた。これは期待以上の進展であった。（２）のアグロインフェクションによる同期的抵抗性誘導系ではCMV(Y) RNA1 cDNAの大腸菌毒性により目的のコンストラクトが得られないなどの問題があったものの、CMV(TN)系統の利用によりこれを解決できた。また、ER同期的誘導にむけてPVXベクタの利用も検討しうることが明らかになった。（１）（２）を総合すると、すべてが期待通りではないものの、おおむね順調に進展していると言えるものと考えられた。
|
| 今後の研究の推進方策 |
CMVの3分節を1つのバイナリベクタに挿入したコンストラクトを作製し、アグロインフェクションを行う。また、現在使用している35SプロモータからCMV RNAが合成され続けることがERの完全な再現の障壁になっている可能性が考えられるため、やや弱いプロモータなど、異なるプロモータの使用を検討する。PVXベクタについても同様の検討を行い、同期的ER誘導系の構築を目指す。一方で、同期的HR誘導系はすでに構築できていることから、異なる抵抗性誘導強度のRNA3で植物の抵抗性応答がどのように異なるかを遺伝子発現変動の解析により調べる。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
RNA-seq解析を次年度に回したため、本年度の使用額が小さくなった。また、プロジェクト経費ではない経費（運営費交付金・寄付金等）を中心に本研究を遂行することができたこと、コロナウイルス流行で学会旅費が発生しなかったことなどにより、RNA-seq以外の予定費目についても使用額が小さくなった。次年度ではRNA-seq解析や旅費などで助成金を使用する見込みである。
|
