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本申請では、カイコ染色体の特徴を利用し、効率よく細胞内で維持可能な人工染色体の構築を目指す。細胞外から導入されたDNAが、細胞内に長期間維持されるには、効率の良いDNA複製と分配が必要である。
本年度は、DNA上に動原体タンパク質複合体を局在化させる技術開発、さらに、細胞内におけるタンパク質量の制御に関する技術基盤、および、遺伝子に様々なタグを簡便に付加できるシステムの整備、および、他生物におけるテロメア結合タンパク質のカイコホモログの機能解析を行った。
昨年度、構築した長鎖環状DNAに、リピート配列を複数導入し、dCas9とgRNAを発現させることで、細胞へ導入したプラスミドの可視化を試みた。また、様々なリピート配列を解析するため、dCas9-gRNA発現ベクターが簡便に構築できるよう改良を行った。しかしながら、既存のEGFPでは明確なシグナルが得られなかったため、現在、リピート数の増幅と退色が少なくより明るい蛍光タンパク質使用した解析を進めている。
次に、染色体安定維持のためには、染色体末端が安定的に保護される必要があるが、カイコテロメア末端維持については知見が少ないため、その機構に関わる遺伝子の解析を行った。カイコゲノムには、ヒトや酵母などのモデル生物においてテロメア末端で機能する遺伝子のホモログがみつかっていない。そこで、AlphaFold2による構造類似度を指標に検索すると、テロメア末端で機能するシェルテリン複合体に含まれる遺伝子と非常によく似た遺伝子を同定した。今後は、この遺伝子と相互作用する遺伝子を単離し、カイコ動原体遺伝子とテロメア局在遺伝子を利用することで、染色体の安定維持機構の解明を行い、人工染色体への応用を試みる。
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