| 研究課題/領域番号 |
21K05621
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| 研究機関 | 東北学院大学 |
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研究代表者 |
土原 和子 東北学院大学, 教養学部, 准教授 (10300823)
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| 研究分担者 |
飯塚 哲也 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門, グループ長補佐 (80414879)
高梨 琢磨 国立研究開発法人森林研究・整備機構, 森林総合研究所, 主任研究員 等 (60399376)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 機械受容 / 聴覚 / 感覚毛 / カイコ / トランスジェニック |
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| 研究実績の概要 |
2022年度は、昨年度決定したカイコの系統（遺伝子操作がすでにおこなわれている系統）から,顕微鏡下で確認しながら音受容性の機械感覚子の細胞体と音受容性ではない機械感覚子の細胞体を別々に多数(200-300本）集め、total RNAの抽出をおこなった。RNAの抽出後、以下の２つの実験をおこなった。
１）既知の音受容に関わる遺伝子の探索 ショウジョウバエにおいては音受容に関わる遺伝子がすでに同定されている。TRP channelが音受容に関わっていることがわかっているので、カイコの遺伝子データから相動性の高い遺伝子を探索した。すでにカイコではTRP channelが同定されていたが熱感受性として同定されている。そこで、機械受容体の細胞体にTRP channel遺伝子があるか確認した。現在のところRT-PCRにおいては遺伝子の増幅は確認できていない。
２）カイコ機械受容体細胞からの新たな音受容体遺伝子の探索 ４齢から５齢になる眠の時期にDNAからRNAへの転写がおこなわれると考えられるので、その時期のカイコから、音受容性の機械感覚子を細胞体ごと300本、音受容性ではない機械感覚子も同等数集め、RNAを抽出し、RNAseqをおこなった。詳細な解析はこれからであるが２種類の感覚子においてわずかながら差がみられた。ただし、細胞体の大きさが違うことから、音受容性の機械感覚子のRNAの量が少なく、読めた遺伝子の数が少ない可能性もあるため、量を増やしてもう一度RNAseqをおこなうほうがよいと考える。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
カイコの聴覚をモデルとして、チョウ目の幼虫にみられる新たに発見した感覚子型の「聴覚器」の特性を、2022年度は分子からの解析の研究を遂行した。
チョウ目幼虫のカイコにおける音受容体の同定および機能解明を目指すにあたり、３年間で以下の３つの項目を計画した。1) 感覚子（音受容器）が受容する周波数の特定、2) 感覚子における音受容体遺伝子の同定、3) その遺伝子の機能解析（ノックアウトカイコの作成による行動実験）、を行うことにより、音受容体の分子的同定と機能を解明する。その中で2年目の2022年度の研究実施計画としてあげた以下の２項目について記す。
①昨年度、新たに発見した感覚子型の「聴覚器」において行動実験で感覚子が重要な役割を果たしていることがわかったので、その分子機構を明らかにするために、顕微鏡下で確認しながら音受容性の機械感覚子と音受容性ではない機械感覚子を細胞体ごと集めtotal RNAの抽出をおこなった。
②それぞれのRNAから１つは既知の遺伝子を用いたRT-PCRによるTRP channelの同定を、もう１つは新規の音受容性の遺伝子の同定を目指し、音受容性感覚子特異的な遺伝子の同定を目的として遺伝子間のディファレンシャル（差をみる）をおこなうことためにRNAseqをおこなった。
５に既述したように、計画に対して、一定の結果がでているが、以下の理由によりやや遅れている。1)９月頃までコロナの影響で、大学構内における実験が制限されたこと。また、コロナの影響により業者からの必要な消耗品が欠品しており納品が遅れた。2)RNAseqをおこなったが、音受容性の感覚子の細胞体から抽出したRNAの量が少なかったため、満足な結果が得られなかった。そこで、３年目にもRNAseqをおこなう必要がある。以上により、やや遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
３年目の2023年度は、2022年度に取得できたRNAseqのデータ解析をおこなう。遺伝子解析は以下の２つを考えている。
1)音受容性の感覚子の細胞体から採取したRNAから作成されたライブラリーの遺伝子配列のデータを確認する。そのデータをショウジョウバエなどの音受容に関わる遺伝子や、機械受容に関わる遺伝子と相同性があるものを抽出する。
2)新規の音受容性の遺伝子の同定を目指し、音受容性の機械感覚子の遺伝子と音受容性ではない機械感覚子の遺伝子間のディファレンシャル（差をみる）解析をおこなう。音受容性の機械感覚子に特異的な遺伝子が検索できれば、その遺伝子は音受容性の遺伝子の可能性が高いと考えている。
並行してもう一度音受容性の機械感覚子と音受容性ではない機械感覚子を細胞体ごと多量に集め、total RNAの抽出をおこなう。この際、感覚子の数ではなく分光光度計を使用して量をそろえることする。RNAseq解析の終了後は、上記と同じく遺伝子解析をおこなう。
遺伝子解析により音受容性遺伝子の候補が同定できた場合は、以下の２つの実験を行う予定である。１つ目はRNAseqで特定した遺伝子の発現場所や発現時期などの遺伝子解析をおこなう予定である。また、その遺伝子をノックアウトしたカイコを作成する。作成したノックアウトカイコに対して、音や振動を提示して、行動の有無を確認する。機能の消失が確認できた場合は、また遺伝子を戻したレスキューのカイコを作成する。そして、音や振動を提示する行動実験により、音受容に対する行動が消失すること、そして、レスキューした個体については、機能が回復するかを確認する。以上により、カイコにおける機械感覚子による聴覚の分子機構を解明する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究費に関しては、コロナの影響で研究室で予定通り実験を遂行できなかったため、RNAseq解析を予定していた研究費のかなりの部分が使用できていない。その他、使用されていない部分はコロナ禍により消耗品が予定通り調達できなかったものがある。調達できなかった物品に関しては、2023年度に必要物品を購入予定である。2022年度の実験計画の少し遅れている部分に関しては、2023年度初めに実行予定である。輸入品や、発注依頼をかけてから作成する物品等に関しては、部品不足や購入できないことも考えられる。コロナは2023年度は落ち着いていると考えられるが、世界情勢を鑑み、予定物品の調達は早めにおこない、購入不可の物品に関しては代替品の購入など、早めの対処を行う予定である。
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