| 研究課題/領域番号 |
21K05867
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
中山 真由美 東北大学, 生命科学研究科, 博士研究員 (70814317)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 環境応答 |
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| 研究実績の概要 |
シロイヌナズナにおいて環境ストレス回避の前後で変動する液胞局在の膜タンパク質の機能解析を行うことによって，根の環境応答機構における液胞の役割を見出すことを目的に，以下の研究を実施した。
液胞動態変化または環境ストレス耐性に関与する因子の探索と機能解析:
(1)出芽酵母過剰発現系の構築: 先行したプロテオーム解析により，シロイヌナズナ根において，環境ストレス回避の前後で機能する可能性のある候補タンパク質について近縁種植物等の調査を進め，オルソログ候補遺伝子についてリストを作成し，出芽酵母で過剰発現系の構築を進めた。一方で，当初予定していた発現系では，液胞トランスポーター等の膜タンパク質については，取り込みや排出が過剰になることで致死性を示す可能性が示唆されたことから，‘well-tempered’ controllerによる転写制御システムを用いた候補遺伝子の発現系も併せて構築を進め，候補タンパク質の最適発現量の検討を行った。また，これらの形質転換体を用いた環境ストレスやオートファジー誘導時のプロテオーム解析を進めている。
(2)大腸菌過剰発現系の構築: 出芽酵母と同様に候補ついては，近縁種植物等のオルソログ候補遺伝子を調査し，大腸菌での過剰発現系の構築を進め，それらの培養液について分析を進めた。 (1)，(2)の候補にはトランスポーター以外の膜タンパク質も含まれており，解析手法等を検討し，液胞局在の膜タンパク質の機能解析を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
計画通り出芽酵母および大腸菌において候補遺伝子の過剰発現系の構築を進めたが，候補タンパク質の最適発現量の検討に時間を要しているため遅延している。
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| 今後の研究の推進方策 |
(1)出芽酵母過剰発現系の構築: 引き続き，候補タンパク質の発現量を最適化した出芽酵母の形質転換体において，オートファジー誘導時の液胞の挙動を解析することで，候補分子による基質の取り込みと排出の有無を確認し，液胞動態への影響について蛍光試薬等を用いて形態学的な解析を行う。 また，有効な過剰発現体については，プロテオーム解析を行う。
(2)大腸菌過剰発現系の構築: 大腸菌においても過剰発現体作出時やオートファジー誘導時に，致死性を示す可能性も想定している。その際は，大腸菌での候補遺伝子の発現量を最適化した過剰発現系を構築し，菌体培養液中に排出または菌体内に蓄積する物質をメタボローム解析により輸送物質を同定し，機能を推定する。
(1)，(2)の推進により，候補とした液胞局在の膜タンパク質の根の環境応答機構における機能を明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
出芽酵母での候補タンパク質の最適発現量の検討に時間を要し，(1)および(2)で実施を予定していたプロテオーム解析およびメタボローム解析が延期したため，これらの解析にかかる物品費，装置使用料が次年度使用額として生じた。次年度にプロテオーム解析およびメタボローム解析の実施を計画している。また，候補の特性から派生した解析や検証を行う研究協力先での研究実施を次年度に計画している。
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