| 研究課題/領域番号 |
21K05914
|
|---|
| 研究機関 | 帯広畜産大学 |
|---|
研究代表者 |
石川 透 帯広畜産大学, 畜産学部, 教授 (70249960)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2025-03-31
|
| キーワード | 異所性強制発現系 / 膜電流 / パッチクランプ法 / 細胞内酸塩基状態 |
|---|
| 研究実績の概要 |
これまでの電気生理学的手法（ホールセルパッチクランプ法）を用いた機能的探索実験により、ウシ耳下腺腺房細胞にはナトリウム重炭酸イオン共輸送活性に依存して変化しうる細胞内酸塩基状態を感受し、機能変化するようなイオン輸送タンパクが存在する可能性があります。しかし、そのようなイオン輸送タンパクの全貌と詳細な分子機構は不明のままです。前年度に続き、令和５年度はウシ耳下腺腺房細胞において細胞内酸塩基状態変化により影響を受ける可能性がある既知のイオン輸送タンパク活性に焦点を当て、異所性強制発現系（目的のイオン輸送タンパクを強制発現させた哺乳類培養細胞）を用いてホールセルパッチクランプ法による電気生理学的実験を行いました。ウシ耳下腺腺房細胞での実験と同様に、高濃度のカルシウムキレート剤（EGTA）を含むピペット溶液で細胞内遊離カルシウムレベルを低い状態に設定し、目的のイオン輸送タンパク活性に起因する膜電流を測定し、細胞内酸塩基状態の影響について調べました。同一実験条件下にもかかわらず、ウシ耳下腺腺房細胞に内因性に発現するイオン輸送タンパク活性とは異なり、強制発現系で観察されるイオン輸送タンパク活性は少なくともテストした細胞内酸塩基状態においてほとんど影響をうけないことがわかってきました。今後、その分子機構の解明を進めるとともに、「細胞内酸塩基センサー分子」としての新規イオン輸送タンパクの機能的探索実験も継続しながら、本研究課題をさらに進めていきたいと考えています。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
これまでの研究では、主な実験系として非常に高い重炭酸イオン分泌能を有するウシ耳下腺から新鮮分離した腺房細胞を用い、ナトリウム重炭酸イオン共輸送活性の監視および機能調節という、いわゆる「細胞内酸塩基センサー分子」としての新規イオン輸送タンパクの同定を目指した機能的探索実験を行ってきました。その機能的探索実験の過程において、既知のイオン輸送タンパク活性に起因する膜電流がナトリウム重炭酸イオン共輸送体活性とリンクする（あるいはリンクして変動する可能性がある）細胞内酸塩基状態に影響を受ける可能性があることを想定外に見出し、そのイオン輸送タンパク強制発現系を用いた検討にも多くの時間を費やしてきました。そのため、細胞内酸塩基センサー分子としての新規イオン輸送タンパクの機能的探索と分子同定およびナトリウム重炭酸イオン共輸送体分子の細胞内機能調節タンパクの細胞内酸塩基センサーとしての分子特性に関する研究が遅れています。
|
| 今後の研究の推進方策 |
令和６年度もウシ耳下腺腺房細胞に存在する可能性がある細胞内酸塩基センサーとしての新規および既知のイオン輸送タンパクの機能的探索を新鮮分離標本や強制発現系を用いて継続・推進していきたいと考えています。また、ウシ耳下腺腺房細胞に内因性に発現しているナトリウム重炭酸イオン共輸送体およびその細胞内機能調節タンパクの細胞内酸塩基センサーとしての分子特性についても、分子生物学的手法や異所性強制発現系などの実験系を総合的に用いながら推進したいと考えています。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
「現在までの進捗状況」の項にも記したように、研究の過程で想定外の研究結果を得たこともあり、当初予定していた実験計画の遅延と新たな実験の追加等が生じました。そのため、電気生理学的実験や分子生物学的実験等で予定していた消耗品経費（電気生理学実験用消耗品、細胞培養試薬および器具、一般試薬や分子生物学試薬等）やその他の経費（DNAシークエンス解析外注等）の支出がおさえられたため繰り越し金が生じました。これら繰り越し分は令和６年度に実施する実験およびその進展状況にあわせ無駄なく計画的に使用する予定です。
|
