| 研究課題/領域番号 |
21K05936
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| 研究機関 | 山口大学 |
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研究代表者 |
日下部 健 山口大学, 共同獣医学部, 教授 (20319536)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 眼球 / 網膜 / 発生 / 補体 |
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| 研究実績の概要 |
C57BL/6Jマウスにおいて、眼杯形成期に相当する妊娠10.5、12.5、14.5日で胎子を採取した。この時期は血管は形成されているが、胎子自身のタンパク産生能は低いため、リガンドは母体由来の因子が血行性に作用する可能性がある。よって母体組織も採取し（肝臓、胎盤、乳腺）、解析に用いた。
ニワトリ胎子において網膜の発生に重要と考えられている補体タンパクC3の局在および妊娠動態を調べた。採取時期のマウス胎子は眼球のみを取り出すことは困難であったため、頭部または全身を解析対象とした。ウエスタンブロッティング解析の結果、C3は妊娠12.5日の胎子組織からは検出されなかった。妊娠14.5日になると、マウス頭部においてC3タンパクの局在を明瞭に確認することができた。
母体組織では、C3の主要な産生臓器とされている肝臓での局在を確認したが、乳腺、胎盤においても局在を確認した。タンパクレベルでは、むしろ後者の方がC3の産生量が多いように思われた。
妊娠14.5日では眼杯の形成はかなり進んでいるため、既報のあるニワトリ網膜とは違い、マウス胎子ではC3は網膜の初期細胞分化に関与しない可能性が考えられた。一方、網膜の形成後期には、過剰なシナプスの消去や神経細胞の選択・除去に補体タンパクが寄与するとの報告がある。計画していた対象の時期を広げて、解析を展開する必要性が認められた。C3の作用に関して結論は得られなかったが、胎子網膜の発育には、妊娠母体由来のC3が遠隔性に胎子へ影響している可能性が示された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
マウス胎子の網膜、眼球の標本採取に苦慮した。標本から解析に有効なタンパク量を抽出するために、試行錯誤を繰り返した。
対象の解析範囲を広げることで、有効なタンパク濃度を得ることに成功した。一方で、解析の詳細性は低下したため、組織切片を作製して補足的な解析を行う必要が生じた。胎仔網膜の組織切片の作製も困難であった。
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| 今後の研究の推進方策 |
組織切片を用いた免疫組織科学的解析、RNAを用いたRT-PCR解析を行い、網膜におけるC3
およびC3aRの局在、妊娠期における変化を調べる。先のウエスタンブロット解析の対象範囲を妊娠後期、出生後の新生子期にも展開し、C3、C3aRの高発現時期を同定する。新生子期については、出生直後、網膜が薄化する生後5日目、組織構造が完成する15日目を基準とする。
高発現時期が妊娠初中期の場合には、レセプターを介した細胞分化に対する影響を検証する。C3aRに対するモルフォリノオリゴを作製し、妊娠母体に投与して新生子網膜への影響を見る。
高発現時期が妊娠後期～新生子期の場合は、補体の傷害作用による網膜シナプスの除去作用について検証する。新生子に抗C3抗体を投与して、網膜形成への影響を調べる。
新生子期における補体の網膜成長に関しては、ウシ眼球を用いた解析も進める。ウシはマウスよりも網膜の生後成長速度が速い。C3の量的および分布に関する検証を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
マウスの解析のために購入希望にしていた行動解析ソフトについて、その利用対象、適用範囲が不明確で、メーカーに説明を求めたが内容が不十分であった。代替ソフトを調べたが、予算の範囲で購入可能なものを見つけることが出来なかった。そのためソフトの購入を取りやめ、物品の充実のために資金の用途変更を行った。
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