| 研究課題/領域番号 |
21K05940
|
|---|
| 研究機関 | 大阪公立大学 |
|---|
研究代表者 |
中川 博史 大阪公立大学, 大学院獣医学研究科, 講師 (60336807)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
|
| キーワード | 微小プラスチック / ポリスチレン / リソソーム / オートファゴソーム / エンドソーム / Caco-2細胞 |
|---|
| 研究実績の概要 |
経口摂取された微小プラスチックが消化管粘膜にどのような毒性を与えるのかを明らかにする必要がある。培養腸管上皮細胞に取り込まれた微小プラスチック粒子がリソソームに集積する事例に着目し、プラスチック粒子のリソソームの機能に対する影響について検討を行い、微小プラスチック毒性の新たな作用点・作用機序の解明を目的とした。
腸管上皮モデル細胞株であるCaco-2細胞を用いて、直径0.1 μmのポリスチレンビーズを細胞に取り込ませた結果、特異的な細胞死や増殖抑制は見られなかったものの、リソソームの膨化が観察された。2022年度実施予定であった研究内容の改善法として、細胞内に取り込まれたビーズ量を測定するために、ビーズの蛍光強度を生細胞イメージングにて検出していたが、手技の安定性および検出感度の問題があり定量的なデータ解析に難があると考えられため、固定標本による通常の蛍光顕微鏡観察をもって細胞内取り込み量の検出・定量化を試みた結果、より定量的な解析に適したデータが得られるようになった。
リソソームの障害の一つであるリソソーム膜の不完全性（膜透過性の亢進）を検出しようと試みた。リソソームの腔内に局在する酵素カテプシンの減少を免疫蛍光法で検出したが、細胞質内への漏出を示す細胞質内でのカテプシン酵素活性を検出することが出来ず、証明には至らなかった。そこでリソソーム膜透過性亢進の最も鋭敏な検出法である蛍光タグ付加Galectin3発現プラスミドの細胞への導入を試みたが、実用に足る遺伝子導入効率の条件を探し出せず、実験結果は限定的な物に留まっている。また前年度に得られた結果である、オートファジーにポリスチレンビーズ取り込みが与える影響についての評価のため、蛍光体タグ付加LC-3B発現プラスミドの細胞への導入も試みたが、実用に足る遺伝子導入効率の条件を探し出せず、実験結果は限定的な物に留まっている。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
直径0.1 μmの蛍光ポリスチレンビーズをCaco-2細胞に取り込ませ、リソソーム内にポリスチレン粒子の集積が見られることが確認された。リソソームの膨化が起きていることが明らかとなったため、リソソーム機能障害の有無を調べるために、膜の破綻があった場合にリソソーム腔内に集積し蛍光を発するmAzG-Galectin3発現プラスミドを導入した細胞にポリスチレン粒子を取り込ませたところ、一部の細胞で斑状の蛍光が検出され、リソソーム膜透過性亢進が生じていることが明らかとなったが、遺伝子導入効率が最大で8％程度と非常に低く、導入効率の向上を目指して条件検討を試みたが未だ至適条件を見つけるには至っていない。またオートファゴソームの観察に、昨年度に用いた簡便法であるMonodansylcadaverine染色法を用いた結果しか得られていないため、間接的なオートファゴソーム蓄積の証明を行っているに過ぎず、研究成果として論文投稿するために、より標準的な方法であるGFP-LC3Bタンパク発現プラスミドの細胞への導入を試みたが、上述のmAzG-Galectin-3発現プラスミド同様に、導入効率の向上を目指している段階にある。
一方で、リソソームの障害は細胞死を誘導しなくとも腸管上皮機能への障害を与える可能性があるという観点から、腸上皮のバリア機能への影響が考えられたため、経上皮電気抵抗(TEER)の測定により腸上皮バリアへのポリスチレン粒子の影響を調べた結果、有意にTEERの減少を誘導することが判明した。
|
| 今後の研究の推進方策 |
得られた結果については、事前に予想した結果と大きな差異は認められなかったため、研究目的・方針に大きな変更はない。
令和4年度実施予定であったリソソーム障害の詳細な解析については、令和5年度においてmAzG-Galectin3タンパク発現プラスミドの遺伝子導入効率を向上させ、論文投稿レベルに耐えうるレベルでの実験系にて、リソソーム膜透過性亢進がポリスチレン粒子により惹起されることを明らかにする。また同様にオートファジー検出の標準的手法であるGFP-LC3Bタンパク発現プラスミドの遺伝子導入効率の向上についても検討を行い、ポリスチレン粒子の影響を評価する。またリソソーム内腔局在酵素の細胞質への漏出が起きているのかについて証明を試みる。現在準備段階にて既に局在酵素の漏出を検出できており、当初の予想通りの結果が得られる考えられる。
また本来令和5年度に実施予定であった内容についても、内容的に同時進行が可能であることから、実験を実施する。具体的には、現在使用している表面修飾と異なる修飾を持つ荷電状況の異なるポリスチレンビーズ、またはポリスチレン以外のビーズについても、今回得られた結果と同様に細胞内に取り込まれるのか、リソソーム障害性を持つのかについて検討を行う
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
一部の研究実施項目に遅れがあったため試薬購入の減少により予算余剰が生じた。
緑色蛍光タグ付加LC-3Bタンパク発現プラスミドGFP-LC-3BをCaco-2細胞に導入し、オートファジーへのポリスチレン粒子の影響を評価する予定であった。加えて同様の手技を用いる研究として、緑色蛍光タグ付加Galectinタンパク発現プラスミドmAz-Galectin-3をCaco-2細胞に導入し、リソソーム膜透過性亢進の量的変化を蛍光顕微鏡観察により実施する予定であった。しかし両プラスミド共に導入効率が非常に低く(1～5%)、期間内に使用に耐えうる導入条件を決定することが出来なかった。そのため未だに本実験には取り掛かれていないため、導入試薬の消費量が少なかったことに加え、蛍光顕微鏡の水銀ランプの使用時間も当初の予定より低下しており、本年度における購入の必要がなくなったことなどから、予算に剰余が生じた。
|
