| 研究課題/領域番号 |
21K05980
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| 研究機関 | 甲南大学 |
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研究代表者 |
向 正則 甲南大学, 理工学部, 教授 (90281592)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 卵形成機構 / 熱ストレス / オートファジー |
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| 研究実績の概要 |
熱ストレスに対する応答を中心に、生殖細胞の品質管理や制御に関わる分子機構の解析を進めている。2021年度の研究から、熱ストレス（38°C）の処理により、生存率を顕著に低下させずに卵形成過程を阻害できることが判明した。また、熱処理後に25°Cの飼育温度に戻すことにより、数日後に卵形成過程が回復することが明らかになった。熱ストレスによる卵形成の阻害、障害とその後の回復を、卵室の組織レベルで簡便に解析する方法、及び妊性の回復を評価できる実験系が完成した。この実験系を用いて、Trf2をノックダウンし、回復に対する影響を調べた結果、妊性の回復が遅れる傾向が観察された。Trf2が熱ストレス後の卵巣の回復に関わる可能性が示唆された。Trf2 のノックダウンの影響を細胞レベルで解析し、Trf2が関与する細胞応答の実態を明らかにすることを目的として、2022年度は以下の研究をおこなった。熱ストレス誘導性の中期卵室の障害は、飢餓誘導性のものと類似する。飢餓誘導性の中期卵室の崩壊には、オートファジー、アポトーシス反応が関与する。そこで、熱ストレス誘導性の中期卵室の崩壊にオートファジー、アポトーシス反応が関与するかを中心に解析を進めた。オートファジー反応を検出するためのマーカー系統 (GFP-LC3系統) を用いて、熱処理によりオートファゴソーム小胞の形成が促進されるか解析を行った。その結果、熱ストレス誘導性の卵室の崩壊過程において、オートファゴソーム小胞の形成が促進され、オートファジーが誘導されることが明らかになった。TUNEL法による組織化学染色を行い、熱ストレスにより卵巣中でアポトーシスが誘導されるか解析した結果、熱ストレス条件下では、アポトーシス反応が顕著に誘導されないことがわかった。熱ストレス誘導性の中期卵室の崩壊および妊性回復にオートファジー反応が関与することが判明した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
2021年度は、熱ストレスが卵形成過程に与える影響を解析し、Trf2が熱ストレス後の卵巣の回復に関わる可能性が示唆された。2022年度において熱ストレス誘導性の卵室崩壊の制御にオートファジーが関与することが明らかになってきた。オートファジーの制御に関わる遺伝子がショウジョウバエにおいても同定されており、いくつかの遺伝子（Atg1, Atg5, Atg8a, Atg8bなど）のノックダウン実験が現在進行している。これまでにオートファジーに関わることが報告されているDcp-1, p53遺伝子についても卵巣中での機能が報告されているため、熱ストレス後の妊性回復の制御に関わる可能性が予想された。このため、これらの遺伝子のRNAi系統を用いてノックダウン実験を進めた結果、Dcp-1, p53遺伝子が熱ストレス後の妊性回復の促進に関わる可能性を示唆する先行的な結果が得られている。熱ストレスにより誘導される卵巣の反応に関わる制御因子の候補、Atg1, Trf2, Dcp-1, p53が明らかになりつつあり、解析の糸口が掴めた状態になっていると言える。Trf2, p53は転写制御に関わる因子であり、これらがオートファジー関連遺伝子の制御にどのように関わるのか解析することにより、生殖細胞の品質管理に関わる遺伝子ネットワークの理解の基礎が得られると予想できる。研究の進捗状況としては、概ね順調と評価できる。
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| 今後の研究の推進方策 |
上述のTrf2のRNAiノックダウン実験により、妊性の回復が抑制されることが判明した。Trf2が熱ストレスからの妊性回復に十分な因子であるかを明らかにするために、Trf2強制発現を行い、熱ストレスからの妊性の回復が促進されるかを検討する。オートファジー関連遺伝子（Atg1, Atg5, Atg8a, Atg8bなど）のノックダウン実験を行い、熱処理後の妊性回復に対する影響を調べる予定である。また、これらの遺伝子のノックダウンが卵巣組織に与える影響をオートファジーマーカー（GFP-LC3系統）の動態、オートファジー後に起こる生殖細胞の濾胞細胞による貪食過程を中心に解析する。オートファジーが熱処理後の生殖細胞を守るのか、損傷を受けた細胞を取り除き、組織として生殖細胞の品質を守るのかを検討する。RNAi系統を用いてノックダウン実験を進めた結果、Dcp-1, p53遺伝子が熱ストレス後の妊性回復の促進に関わる可能性が明らかになりつつある。これらの遺伝子の突然変異体を用いて解析を行い、表現型の確認を行う。Trf2, p53は転写制御に関わる因子であり、これらをノックダウンし、オートファジー関連遺伝子の発現にどのような影響を与えるかを解析し、Trf2, p53の下流で作用するオートファジー関連遺伝子を明らかにする。上述の解析からTrf2が熱ストレスからの妊性回復に十分な因子である場合には、オートファジー関連遺伝子ノックダウンにより、Trf2強制発現の影響が抑制されるか調べ、Trf2の下流で作用するオートファジー関連遺伝子を機能的に解析する。これらの解析を通じて、オートファジーを中心とした生殖細胞の品質管理に関わる遺伝子ネットワークの解明を試みる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度、熱ストレス誘導性の卵室崩壊の制御にオートファジーが関与することが明らかになってきた。オートファジーの制御に関わる遺伝子がショウジョウバエにおいても同定されており、いくつかの遺伝子（Atg1, Atg5, Atg8a, Atg8bなど）のノックダウン実験が現在進行している。これまでにAtg1が妊性回復に関わる候補として明らかになっている。しかし、熱処理条件によって誘導されるオートファジーの性質が変わる可能性が判明したため、実験条件の再検討が必要になった。Trf2遺伝子の下流遺伝子として、どのオートファジー関連遺伝子の発現を調べるかまだ明確でない状況である。このため、遺伝子発現を調べる定量RT-PCRの試薬などの経費の執行が遅れている。今年度、実験条件の再検討を進め、Trf2遺伝子の下流遺伝子の発現を解析する。ノックダウン実験定量RT-PCR解析に必要な試薬や消耗品の費用として、余剰分の予算を使用する予定である。
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