| 研究課題/領域番号 |
21K05994
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
三輪 佳宏 国立研究開発法人理化学研究所, バイオリソース研究センター, 室長 (70263845)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | コラーゲン / 肝炎 / 線維症 |
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| 研究実績の概要 |
第１世代HaloTagマウスを応用した、成長過程の解析と線維症のin vivo解析（R3年度）として、すでに樹立がかなり進行している第１世代HaloTagマウスは、好きなタイミングで好きな色のHaloTag ligandを投与し共有結合により不可逆的にコラーゲンを染色できる。ホモマウスはプローブ化V型コラーゲンのみを発現するため、その性質を解析した。ヘテロマウスの交配による出産数が完全にメンデルの法則に従うことから、HaloTagマウスは問題なく生存できることが示唆された。またホモマウス同士の交配も問題なく出産し、成長期の体重が野生型と全く同等であり、コラーゲン異常によく見られる表現型が全く観察されなかった。以上のことから、我々の技術でコラーゲン線維の機能が完全に維持できていることを証明した。次に、イメージングを実施するために、生きたマウスへのHaloTag ligand投与と、摘出した臓器の染色法の２つの方法を検討し、いずれも適切な条件を設定し、イメージングを実施可能となった。胎仔をライトシート顕微鏡で３次元撮影することにより、成長期のコラーゲン産生の全体像を明らかにすることができた。また成体において、一般にコラーゲンが多いと考えられている組織で蛍光輝度が高かった。また肝炎誘導マウスにおいて、肝臓で高輝度の蛍光が検出された。以上のことより、我々の技術でコラーゲン線維の機能が完全に維持できていることを証明することができた。
また、テーマ４のin vitroでの解析に関して、コラーゲンの構造的特徴を偏光を用いて光学的に非常に簡便に解析できる新しい手法の開発に成功した。さらに、リアルタイムに継続して動画として捉える新しい培養装置の開発も進んでいる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
初年度に予定していた、申請者らの技術の証明に関して、当初の予定以上に成果を得ることができた。一方で、テーマ２の近赤外への対応については、蛍光タンパク質の問題を完全には克服することができなかったが、現在別の方法での克服の可能性が見出されている。この２つを合わせて、全体としては概ね順調に進展していると判断できる。
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| 今後の研究の推進方策 |
テーマ２の近赤外への対応法について、引き続き検討を進める。
これと合わせて、２年度めに予定していたテーマ３、および４を推進する。
３. 第２世代動物モデルの樹立と成長過程の解析と線維症のin vivo解析（R4年度以降）：テーマ２で開発した細胞外近赤外技術を応用したマウスを樹立する。コラーゲンプローブの発現は、cre-loxPの応用により、希望する組織や臓器特異的に実現する。このマウスでは、生きたまま非侵襲での経時的なイメージングが可能になるため、１で実施した内容を完全リアルタイムに解析することを実現する。
４. in vivo解析を分子レベルで支える培養系in vitro解析系の構築（全期間）：コラーゲン分泌系が稼働しない一般的培養法に対して、申請者が見いだしたコラーゲン分泌が起こるQuasi-in vivo培養法において、RNA-Seqにより発現遺伝子を網羅的に解析する。リストアップされた候補遺伝子をノックダウン・過剰発現しコラーゲン分泌の有無のみならず、細胞内のどの部分で停止・蓄積するかをイメージングによって解析し、未知な部分が多いコラーゲン輸送・分泌の分子メカニズムを明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
新型コロナウイルス感染症の影響により、動物実験の開始が大きく遅れたため、動物の飼育のために予定していた実験の一部を次年度に実施することになったため。
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