| 研究課題/領域番号 |
21K06035
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| 研究機関 | 横浜市立大学 |
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研究代表者 |
奥田 昌彦 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 特任准教授 (60448686)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | RNAポリメラーゼ / 基本転写因子 / タンパク複合体 / NMR |
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| 研究実績の概要 |
RNAポリメラーゼ（RNAP）と基本転写因子TFIIHはどちらも10個以上のサブユニットから成る超分子複合体であり、構造の大部分はＸ線結晶回折法（X線）やクライオ電子顕微鏡（電顕）によって解かれている。しかし、外に突き出たテールやドメイン等は運動性が高い為に見えない。申請者らは、既知のRNAPとTFIIHのX線構造解析や電顕構造解析で見えていない領域間の新たな相互作用を見出した。本研究では、見えている領域を含んだ相互作用領域の複合体構造を核磁気共鳴（NMR）法で決定し、見えていない領域を含むRNAPとTFIIHとの複合体の構造モデルを構築する。
本年度は、RNAP（RNAP-II）の構造モデルを構築した。最初に、大腸菌の発現系から13C,15N標識RNAPサブユニット試料を調製した。多次元 NMR 測定、解析を行い、RNAP サブユニットの構造情報（化学シフト、水素原子間距離、二面角、水素結合）を収集した。これらを制限情報とし計算プログラムを用いてRNAP サブユニットの初期構造を算出した。精密化を行い、最終構造を決定した。RNAP-IIの電顕構造中の該当サブユニットを決定したNMR構造に置換後、エネルギー最小化計算しモデル構造を構築した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ほぼ研究計画通りに進行している。13C,15N標識RNAPサブユニット試料を大腸菌発現系から大量に調製することが出来た。また、NMRスペクトルは大変良好で解析をスムーズに進めることができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
RNAPサブユニットとTFIIH p62サブユニットの複合体の構造決定を行う。13C,15N標識 RNAP サブユニットと非標識 TFIIH p62 サブユニットの複合体と13C,15N 標識 TFIIH p62 サブユニットと非標識 RNAP サブユニットの複合体を調製し、多次元NMR 測定、及び解析を行う。距離、及び二面角制限情報を収集し構造計算を行う。算出した初期構造を対し精密化を繰り返し、最終構造決定をする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
(理由) 構造解析や構造計算等に使用する予定のPC等の購入を見合わせた 。
(使用計画) 今年度購入予定のPC等を次年度に購入し、効率的な研究推進に役立てる。
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