| 研究課題/領域番号 |
21K06042
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
別所 義隆 国立研究開発法人理化学研究所, 放射光科学研究センター, 客員研究員 (70242815)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | DNAフォトリアーゼ / ピリミジン二量体 / 光回復酵素 / XFEL / 時分割結晶構造解析 |
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| 研究実績の概要 |
ＤＮＡフォトリアーゼは、紫外線曝露により生じるＤＮＡピリミジン二量体の損傷を修復する酵素である。その反応には可視の青色光のエネルギーを必要としており、光回復酵素として知られている。この研究では、この酵素の光回復反応において、分子間反応のダイナミクスを構造化学的に明らかにすることを目的とする。我々は、古細菌Methanosarcina mazeiのクラスII-CPDフォトリアーゼ（MmCPDII）をターゲット酵素に選定した。この酵素は、高分解能のＸ線結晶構造が既に報告されており、また分光学的特徴もよく知られているのでこの研究に最適な材料である。今年度、ＸＦＥＬ実験で使用する液体ジェット噴出装置の規格に合うように、MmCPDII単体のマイクロ結晶を作成する条件を検討した。結晶化のタンパク質濃度と温度条件を最適化することにより、80μmサイズの結晶を大量に作成することに成功した。この結晶を用いて、SACLAのXFELと同じビームサイズのＸ線を作り出せるSPring-8マイクロフォーカスビームラインBL32XUにて照射実験を行い、高分解能のＸ線回折が得られることを確認した。次に、結晶中で酵素反応が進まないように嫌気的条件で結晶化させる技術を開発した。MmCPDII中に内包されるフラビン補酵素のスペクトルを計測することで、結晶中の酵素分子が還元型を保つ条件を見出した。BL32XUビームラインによる測定で、嫌気条件結晶に「グリース」を充填剤として使うことで、回折の減衰が抑えられることが確認された。この条件でMmCPDIIのマイクロ結晶を再度準備し、SACLAのBL2ビームラインにて液体ジェット装置から噴出させXFELを照射した。多数のマイクロ結晶から回折データを取得し、解析の結果、還元型結晶構造の初期モデルを構築できた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
古細菌Methanosarcina mazeiのクラスII-CPDフォトリアーゼ（MmCPDII）単体と損傷DNA複合体のマイクロ結晶を効率よく作成する条件を見出した。結晶に混ぜる充填剤を最適化し、SACLA施設にてXFELビーム照射によるＸ線回折データ取得に成功した。
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| 今後の研究の推進方策 |
DNAフォトリアーゼ単体および損傷DNA複合体のマイクロ結晶の作成条件を最適化し、SACLAのXFELビームで構造解析に適した回折データセット取得を目指す。従来のＸ線では分からなかった放射線損傷のない正確な結晶構造を解明し、更には時分割測定により光修復反応のダイナミクスを明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
理由：既存の機材や実験材料を使用して効率よく研究を進めた。研究課題は計画通り進んでいる。
使用計画：研究課題が当初の計画以上に進展するように、次年度使用額を効率よく使用する。
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