| 研究課題/領域番号 |
21K06072
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| 研究機関 | 慶應義塾大学 |
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研究代表者 |
山本 雄広 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (50383774)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 解糖系 / アルギニンメチル化 / セリン合成系 / 脂肪酸合成 |
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| 研究実績の概要 |
非必須アミノ酸であるセリンの生合成経路は一般的に予後の悪いがん種で活発化している事が知られている。これはセリン代謝系を経由した葉酸代謝経路から産出されている核酸が旺盛な細胞増殖能を賄うためと解釈されている。本研究は薬剤耐性をもつ難治性がんにおいて活性化しているセリン生合成経路中の律速酵素であるPHGDHに着目し、その翻訳後修飾レベルが酵素活性にどのように作用するか、また結果としてがんの増殖、化学治療への抵抗性にどのような影響を与えるかを明らかにする事を目的とする。提案研究２年目は、以下の事項について明らかにした。
① 質量分析技術によりPHGDHのメチル化修飾部位を明らかにした。② Acyl biotin exchange法によりPHGDHのS-パルミトイル化部位を同定した。③ ①②に対する修飾阻害剤添加により、薬剤抵抗性乳がん細胞の細胞死が増強した。
これらの結果から、予後不良の化学治療抵抗性乳がんではPHGDHのアルギニンメチル化およびS-パルミトイル化修飾が亢進しており、高活性を維持することでセリン合成能を高く保っていることが分かった。現在、メチル化部位特異的な抗体を作成途中であり、今後抗体を用いて、抗がん剤感受性のちがいによりメチル化動態に差異が認められるか検討する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
今年度は、主にPHGDHの修飾部位の同定に充てた。当初、メチル化部位の同定のために大腸菌リコンビナントタンパク質を用いたin vitro methylation法によって同定を試みたが、メチル化由来のシグナルが微弱で、修飾部位の同定に至らなかった。そこで、293T細胞にFLAGタグを付加したPHGDHを発現させ、粗精製後のタンパク質を質量分析法にてアルギニンメチル化ペプチドの検出を試みた。その結果、3か所のメチル化アルギニン残基を決定できた。各修飾部位に対する変異体作製し、酵素活性を測定したところ3か所中1か所については酵素活性に変化は無かったことから、2か所をcriticalなメチル化部位と同定した。現在この2か所に対してポリクローナル抗体を作成している途中である。
一方、前年度までの研究でPHGDHはS-パルミトイル化修飾を受けることが分かっていたが、考えられうるシステイン残基に点変異を導入しAcyl biotin exchange法によりS-パルミトイル化部位の同定を試み、複数のシステイン残基がその候補部位として見出されている。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度はセリン生合成系代謝酵素PHGDHのアルギニンメチル化修飾部位およびS-パルミトイル化修飾部位を複数個所同定した。最終年度は現在作成中のPHGDHのメチル化部位特異的抗体を用いて、修飾と酵素活性の相関、および、乳がん針生検検体を用いた免疫組織染色を行い、腫瘍内部におけるPHGDHのメチル化レベルについて調べる。また、すでにがん部においてメチル化が認められる解糖系酵素PFKFB3やPKM2のメチル化制御とPHGDHのメチル化制御機構の類似点、相違点について検討を加える。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度予定していたPHGDH修飾部位特異的の作成が遅れているので、当初計上していたメチル化部位特異的抗体を用いた実験に使用する、消耗品費を翌年度に繰り越した。
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