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2022 年度 実施状況報告書

Cas9タンパク質の制御によるCRISPR/Cas9オフターゲット編集の抑制

研究課題

研究課題/領域番号 21K06075
研究機関国立医薬品食品衛生研究所

研究代表者

柴田 識人  国立医薬品食品衛生研究所, 生化学部, 室長 (30391973)

研究期間 (年度) 2021-04-01 – 2024-03-31
キーワードゲノム編集 / Cas9 / タンパク質制御
研究実績の概要

CRISPR/Cas9システムによるゲノム編集技術において、「意図しない変異(オフターゲット編集)」を抑制することが課題となっている。本技術のさらなる安全性の向上を目指すためには、CRISPR/Cas9システムを時空間的に精密に制御することが求められている。一方で哺乳類細胞に発現させたCas9タンパク質が比較的安定であるという報告もあることから、適切なタイミングでCas9タンパク質の発現量を調節するシステムの構築が必要であると考えられている。本研究では、Cas9タンパク質がどのように して哺乳類細胞内で安定に発現するのかその分子機構の解明を試みると共に、この知見を利用するなどして、Cas9タンパク質の哺乳類細胞内での発現量を適切かつ精密に制御するシステムの構築を目指している。
今年度の研究成果は以下の通りである。
1) 昨年度構築した、薬剤依存的にCas9タンパク質の発現を誘導する機構とCas9タンパク質の分解を誘導する機構を組み合わせたシステムについて、特に分解誘導の分子機構に関する検討を行い、想定されるように、E3リガーゼを介したユビキチン-プロテアソーム系によってタンパク質分解されていることを明らかにした。
2) このCas9タンパク質の発現誘導機構と分解誘導機構を組み合わせたシステムについて、用いる分解タグと分解誘導剤を変えることで複数のシステムを用意した。これらを複数の細胞に導入することで、Cas9タンパク質の発現/分解誘導に関する条件検討を行い、Cas9タンパク質を精密に制御する最適な条件を見い出した。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本研究は、Cas9タンパク質の細胞内発現量を制御するシステムの確立と、Cas9タンパク質量の制御がゲノム編集技術における意図しない変異の抑制に対して与え る影響の検討が目的であり、本目的を遂行するためにはCas9タンパク質の発現量を精密に制御できるシステムは必要不可欠である。昨年度に構築した薬剤依存的なCas9タンパク質 の発現誘導機構と分解誘導機構を組み合わせたシステムについて、その分解機構を明らかにしたことで、今後得られる意図しな い変異に関する結果について正しい考察が可能となる。また複数用意した分解システムとこれを導入する細胞の組み合わせを検討することで、Cas9タンパク質の発現量の精密な制御を観察できる最適な実験条件を見出すことができたことから、精密にCas9タンパク質量を制御することによる意図しない変異の抑制への影響を正しく評価することが可能になった。従って本研究は順調に進展していると考えている。

今後の研究の推進方策

これまでに構築したCas9タンパク質の発現誘導/分解誘導システムについて、最適な実験条件のもとゲノム編集を実行し、Cas9タンパク質の発現時間によるオンターゲット編集やオフ ターゲット編集の効率とその割合への影響を検討することで、CRISPR/Cas9によるゲノム編集におけるオフターゲット編集の低減と安全性及び信頼性の向上に寄与で きるシステムの提起を目指す。

次年度使用額が生じた理由

(理由) 研究進捗自体は順調であったが、新型コロナウイルス感染症及びロシア-ウクライナ問題などにより、研究消耗品の入手や実験の実施が困難な時期があり、当該次年度使用額が生じ た。
(使用計画) これまでに構築したCas9タンパク質の発現制御システムを用いて、Cas9タンパク質発現時間とゲノム編集効率やその割合への影響を検討するべく、実験遂行に必 要な一般試薬や実験用プラスティック器具器具などとして相当額を使用する。また研究成果研究成果の発表(論文発表や学会発表)として相当額を使用する予定 である。

  • 研究成果

    (13件)

すべて 2022

すべて 雑誌論文 (5件) (うち査読あり 5件、 オープンアクセス 2件) 学会発表 (8件) (うち国際学会 1件)

  • [雑誌論文] Development of Rapid and Facile Solid‐Phase Synthesis of PROTACs via a Variety of Binding Styles2022

    • 著者名/発表者名
      Xu Hanqiao、Kurohara Takashi、Takano Reina、Yokoo Hidetomo、Shibata Norihito、Ohoka Nobumichi、Inoue Takao、Naito Mikihiko、Demizu Yosuke
    • 雑誌名

      ChemistryOpen

      巻: 11 ページ: e202200131

    • DOI

      10.1002/open.202200131

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Development and Validation of a New Robust Detection Method for Low-Content DNA Using ΔΔCq-Based Real-Time PCR with Optimized Standard Plasmids as a Control Sample2022

    • 著者名/発表者名
      Soga Keisuke、Nakamura Kosuke、Egi Tomohiro、Narushima Jumpei、Yoshiba Satoko、Kishine Masahiro、Mano Junichi、Kitta Kazumi、Takabatake Reona、Shibata Norihito、Kondo Kazunari
    • 雑誌名

      Analytical Chemistry

      巻: 94 ページ: 14475~14483

    • DOI

      10.1021/acs.analchem.2c03680

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Unbiased prediction of off‐target sites in genome‐edited rice using <scp>SITE‐Seq</scp> analysis on a web‐based platform2022

    • 著者名/発表者名
      Narushima Jumpei、Kimata Shinya、Shiwa Yuh、Gondo Takahiro、Akimoto Satoshi、Soga Keisuke、Yoshiba Satoko、Nakamura Kosuke、Shibata Norihito、Kondo Kazunari
    • 雑誌名

      Genes to Cells

      巻: 27 ページ: 706~718

    • DOI

      10.1111/gtc.12985

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Structure?activity relationship study of PROTACs against hematopoietic prostaglandin D<sub>2</sub> synthase2022

    • 著者名/発表者名
      Murakami Yuki、Osawa Hinata、Kurohara Takashi、Yanase Yuta、Ito Takahito、Yokoo Hidetomo、Shibata Norihito、Naito Mikihiko、Aritake Kosuke、Demizu Yosuke
    • 雑誌名

      RSC Medicinal Chemistry

      巻: 13 ページ: 1495~1503

    • DOI

      10.1039/d2md00284a

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Evaluation of Conversion Factor for Rapid Quantification of Authorized Genetically Modified Maize and Soybean in Japan2022

    • 著者名/発表者名
      Norihito Shibata、Keisuke Soga, Miyu Sugino, Jumpei Narushima, Satoko Yoshiba, Tomohiro Egi, Reona Takabatake, Kazunari Kondo
    • 雑誌名

      BPB Reports

      巻: 5 ページ: 115~120

    • 査読あり
  • [学会発表] Development of a degrader against oncogenic fusion protein FGFR3-TACC32022

    • 著者名/発表者名
      Norihito Shibata、Nobuo Cho、Hiroo Koyama、Kazunari Kondo、Mikihiko Naito
    • 学会等名
      第81回日本癌学会学術総会
  • [学会発表] ゲノム編集によって発生する意図しない変異はどこから来るのか2022

    • 著者名/発表者名
      近藤一成、曽我慶介、成島純平、吉場聡子、柴田識人、田口千恵、坂田こずえ、加藤怜子
    • 学会等名
      NGS EXPO 2022
  • [学会発表] ゲノム編集におけるオフターゲット予測法SITE-SeqのGalaxyベース新規解析パイプラインの開発とその作物への応用2022

    • 著者名/発表者名
      成島純平、木俣真弥、志波優、権藤崇裕、秋元智、曽我慶介、吉場聡子、中村公亮、柴田識人、近藤一成
    • 学会等名
      NGS EXPO 2022
  • [学会発表] 遺伝子組換え食品の同定に資する新たなゲノム解析技術の検討2022

    • 著者名/発表者名
      吉場聡子、成島純平、曽我慶介、杉野御祐、柴田識人、近藤一成
    • 学会等名
      第59回全国衛生化学技術協議会年会
  • [学会発表] ゲノム編集食品における外来性遺伝子の残存を評価する全ゲノムシークエンスデータ解析の標準化に向けた取り組み2022

    • 著者名/発表者名
      柴田識人、成島純平、曽我慶介、吉場聡子、近藤一成
    • 学会等名
      第59回全国衛生化学技術協議会年会
  • [学会発表] NGSを用いた網羅的なオフターゲット変異候補部位予測法の高GABA産生ゲノム編集トマトへの適用と検証2022

    • 著者名/発表者名
      成島純平、杉野御祐、曽我慶介、吉場聡子、柴田識人、近藤一成
    • 学会等名
      第59回全国衛生化学技術協議会年会
  • [学会発表] ゲノム編集食品の安全性評価における全ゲノムシークエンスデータを用いた解析の標準化に向けた課題2022

    • 著者名/発表者名
      柴田識人、成島純平、曽我慶介、吉場聡子、近藤一成
    • 学会等名
      日本食品衛生学会第118回学術講演会
  • [学会発表] G2/M synchronization with CDK1 inhibitor suppresses genome-wide mutations and genome rearrangements during genome editing2022

    • 著者名/発表者名
      Kazunari Kondo、Nozomi Fukuda、Keisuke Soga、Satoko Yoshiba、Jumpei Narushima、Norihito Shibata、Chie Taguchi、Kozue Sakata、Reiko Kato
    • 学会等名
      CELL BIO 2022 An ASCB EMBO Meeting
    • 国際学会

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公開日: 2023-12-25  

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