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2022 年度 実施状況報告書

ErbB4の部位特異的糖鎖解析による糖鎖機能の解明

研究課題

研究課題/領域番号 21K06083
研究機関札幌医科大学

研究代表者

高橋 素子  札幌医科大学, 医学部, 教授 (00303941)

研究分担者 藤谷 直樹  札幌医科大学, 医学部, 講師 (10374191)
上原 康昭  札幌医科大学, 医学部, 助教 (40882907)
長谷川 喜弘  札幌医科大学, 医学部, 講師 (90643180)
研究期間 (年度) 2021-04-01 – 2024-03-31
キーワード糖鎖 / ErbB4 / 増殖因子受容体 / 質量分析
研究実績の概要

ErbBファミリーは、EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4の4つの分子からなる増殖因子受容体ファミリーであり、いずれもがんの発症・進展に深く関与していると考えられている。特にEGFRやErbB2はがん治療のターゲット分子として臨床応用されているが、ErbB4の関連疾患はがんから精神疾患と幅広く、その機能についても未知の部分が多い。研究代表者はこれまでにEGFR、ErbB2、ErbB3の糖鎖解析を行い、糖鎖の機能を検討してきた。本研究では、ErbB4の部位特異的糖鎖構造解析を行い、糖鎖によるシグナル制御機構を検討した。令和4年度の研究では、以下の結果が得られた。
1)ErbB4の部位特異的糖鎖付加率および糖鎖構造:CHOK1細胞で発現させたヒトErbB4の細胞外ドメインを精製し、LC-ESI-MS/MSを用いて11か所の糖鎖付加ポテンシャル部位における糖鎖付加率と糖鎖構造を解析した。糖鎖付加率に関してはN146とN448の2か所は50%以下と低かったのに対し、他の部位は概ね高い付加率を示した。特にN113、N333はほぼ100%の糖鎖付加率だった。また、N113、N228、N523の3か所は高マンノース型糖鎖、それ以外の8か所は複合型糖鎖が付加することがわかった。
2)ErbB4の機能に重要な糖鎖の同定:CHOK1細胞を用いてErbBの野生型および糖鎖欠損変異体の安定発現細胞を樹立した。ヘレグリン刺激に対するシグナルを比較する予定であったが、タンパク質の発現量が非常に低く、シグナル検出量が一定しなかった。現在、その原因を検討している。
3)ErbB4細胞外ドメインの糖鎖欠損変異体の性質の評価: ErbB4の細胞外ドメインはEGFシグナルとヘレグリンシグナルの両方を抑制することを確認し、その糖鎖欠損変異体の性質を検討している。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

1)ErbB4の部位特異的糖鎖付加率および糖鎖構造の解析:ErbB4細胞外ドメイン(sErbB4)にmyc-Hisタグを付加したものをCHOK1細胞で発現させ、カラムクロマトグラフィーにて精製した。LC-ESI-MS/MSを用いて、11か所の糖鎖付加部位における糖鎖付加率と糖鎖構造を解析した。糖鎖構造解析については当研究室の藤谷直樹助教が担当した。糖鎖付加率に関してはN146とN448の2か所は50%以下と低かったのに対し、他の部位は概ね高い付加率を示した。特にN113、N333はほぼ100%の糖鎖付加率だった。また、N113、N228、N523の3か所は高マンノース型糖鎖、それ以外の8か所は複合型糖鎖が付加することがわかった。
2)ErbB4の機能に重要な糖鎖の同定:CHOK1細胞を用いてErbB4糖鎖欠損変異体の安定発現細胞を樹立した。ヘレグリン刺激に対するシグナルを比較する予定であったが、タンパク質の発現量が非常に低く、シグナル検出量が一定しなかった。CHOK1細胞におけるタンパク質の発現量を規定する因子を1つ1つ検討している。
3)ErbB4細胞外ドメインの糖鎖欠損変異体の性質の評価:ErbB4の細胞外ドメインはシグナル抑制効果があることを確認した。今後、ErbB4の機能に重要な糖鎖を欠損した変異体を作製し、そのシグナル抑制作用と物性を調べる予定である。
ErbB4糖鎖欠損変異体のシグナル解析など、予定より遅れている項目もあるが、部位特異的糖鎖解析はほぼ完了しており、全体として研究計画自体は順調に進んでいると考えている。

今後の研究の推進方策

1)ErbB4の部位特異的糖鎖付加率および糖鎖構造の解析:上記と同様の検討をHEK293細胞にて発現させたErbB4について行い、結果を比較する予定である。すなわち、糖鎖付加率の比較、糖鎖構造の比較を行い、それらを規定する因子について考察したいと考えている。
2)ErbB4の機能に重要な糖鎖の同定:ErbB4は他のErbBと比較して、発現量の多い安定発現細胞樹立が困難であることがわかった。CHOK1細胞におけるタンパク質の発現量を規定する因子(各種アミノ酸の濃度、血清量、その他)を1つ1つ検討し、安定発現細胞を樹立する。その上で、糖鎖欠損変異体の細胞表面の発現量、リガンド親和性、二量体形成能を検討し、シグナル制御メカニズムを明らかにする。
3)ErbB4細胞外ドメインの糖鎖欠損変異体の性質の評価:ErbB4の細胞外ドメインの大量調製に関しては問題はない。2)で同定された、ErbB4の機能に重要な糖鎖を欠損した変異体を調製し、野生型と比較検討する。物性解析としては、X線結晶構造解析、示差走査熱量測定を考えている。その他、リガンドとの相互作用、ErbB4細胞外ドメイン同士の相互作用、あるいはErbB4細胞外ドメインの構造変化のしやすさの指標を検討している。in vitroの実験が困難な場合、MDシミュレーションを行うことで、重要な糖鎖の欠損がどのような影響を及ぼすかの考察をしたいと考えている。現在、機器の整備など、その準備を行っている。

  • 研究成果

    (9件)

すべて 2023 2022

すべて 雑誌論文 (5件) 学会発表 (4件)

  • [雑誌論文] Junctional adhesion molecule 3 is a potential therapeutic target for small cell lung carcinoma2023

    • 著者名/発表者名
      Yamaguchi Miki、Hirai Sachie、Idogawa Masashi、Sumi Toshiyuki、Uchida Hiroaki、Fujitani Naoki、Takahashi Motoko、Sakuma Yuji
    • 雑誌名

      Experimental Cell Research

      巻: 426 ページ: 113570~113570

    • DOI

      10.1016/j.yexcr.2023.113570

  • [雑誌論文] CINC-2 and miR-199a-5p in EVs secreted by transplanted Thy1+ cells activate hepatocytic progenitor cell growth in rat liver regeneration2023

    • 著者名/発表者名
      Inchinohe Norihisa, Tanimizu Naoki, Ishigami Keisuke, Yoshioka Yusuke, Fujitani Naoki, Ochiya Takahiro, Takahashi Motoko, Mitaka Toshihiro
    • 雑誌名

      Stem Cell Research & Therapy

      巻: 14 ページ: in press

  • [雑誌論文] Site-specific analysis of N-glycans of receptor tyrosine kinases2023

    • 著者名/発表者名
      Takahashi Motoko, Fujitani Naoki, Uehara Yasuaki, Hasegawa Yoshihiro
    • 雑誌名

      Trends in Glycoscience and Glycotechnology

      巻: 35 ページ: in press

  • [雑誌論文] Role of glycosyltransferases in carcinogenesis; growth factor signaling and EMT/MET programs2022

    • 著者名/発表者名
      Takahashi Motoko、Hasegawa Yoshihiro、Maeda Kento、Kitano Masato、Taniguchi Naoyuki
    • 雑誌名

      Glycoconjugate Journal

      巻: 39 ページ: 167~176

    • DOI

      10.1007/s10719-022-10041-3

  • [雑誌論文] <i>N</i> ‐glycosylation regulates MET processing and signaling2022

    • 著者名/発表者名
      Saitou Atsushi、Hasegawa Yoshihiro、Fujitani Naoki、Ariki Shigeru、Uehara Yasuaki、Hashimoto Ukichiro、Saito Atsushi、Kuronuma Koji、Matsumoto Kunio、Chiba Hirofumi、Takahashi Motoko
    • 雑誌名

      Cancer Science

      巻: 113 ページ: 1292~1304

    • DOI

      10.1111/cas.15278

  • [学会発表] 肝細胞増殖因子受容体METの糖鎖の構造と機能2022

    • 著者名/発表者名
      高橋素子、齋藤淳、長谷川喜弘、藤谷直樹、有木茂、上原康昭、松本邦夫
    • 学会等名
      第41回 日本糖質学会
  • [学会発表] FGFR1の糖鎖の部位特異的構造解析と機能解析2022

    • 著者名/発表者名
      岡本弘美、藤谷直樹、上原康昭、長谷川喜弘、橋本宇吉郎、有木茂、白土明子、○高橋素子
    • 学会等名
      第95回 日本生化学会大会
  • [学会発表] ヒトErbB2(HER2)の部位特異的糖鎖構造解析2022

    • 著者名/発表者名
      藤谷 直樹, 上原 康昭, 長谷川 喜弘, 橋本 宇吉郎, 有木 茂, 高橋 素子
    • 学会等名
      第95回 日本生化学会大会
  • [学会発表] ヒトRANKの糖鎖による機能制御メカニズムの解析2022

    • 著者名/発表者名
      上原 康昭, 藤谷 直樹, 長谷川 喜弘, 有木 茂, 橋本 宇吉郎, 岡本 弘美, 高橋 素子
    • 学会等名
      第95回 日本生化学会大会

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公開日: 2023-12-25  

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