| 研究課題/領域番号 |
21K06091
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| 研究機関 | 松山大学 |
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研究代表者 |
田母神 淳 松山大学, 薬学部, 准教授 (30580089)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | センサリーロドプシン / レチナール / 光受容タンパク質 / 走光性 / 光情報伝達 / 分子間相互作用 / フォトサイクル |
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| 研究実績の概要 |
高度好塩菌には正および負の走光性を担う2つの光受容タンパク質であるセンサリーロドプシンIおよびII（SRI、SRII）が存在するが、構造や性質的によく類似する両者がどのような分子機構でそれぞれの機能を発揮しているのか、またその機能の違いを生む要因は何かを明らかにすることが本研究の目的であり、この目標を達成するために、安定かつ大腸菌での異種発現による試料の大量発現が可能なHaloarcula vallismortis由来のSR（HvSRI、HvSRII）を用いて検討する。令和3年度は、実験試料であるHvSRIおよびHvSRIIを安定に得るための系の構築と最適化を行うことからスタートした。その結果、いずれのタンパク質においても物性を調べるために十分な量の試料を調製する方法を確立できた。次に、それぞれのもつ基本的な性質を明らかにするために、分光学的な実験を中心に行い、吸収波長やモル吸光係数の算出、光反応サイクル（フォトサイクル）、低塩下や光に対する安定性などについて調べた。HvSRIについては先行研究が存在するが、HvSRIIについてはいまだ報告例がないことから、研究で得られた結果は新規のもので、SRII研究において有益な情報を提供するものと考えている。HvSRIIのフォトサイクル自体は、既知のSRIIとよく類似するものであった。また、低塩下での安定性は安定な既知のSRIIであるN. pharaonis由来のSRII（NpSRII）と同様に高かった。一方で、界面活性剤ミセル中で定常光を照射時に、短波長に吸収をもつ長寿命の中間体が蓄積しやすいというH. salinarum由来のSRII（HsSRII）と共通する性質も見られた。このことから、NpSRIIとHsSRIIとの間をつなぐSRII分子として、両SRIIの比較研究を行う上でも有益なタンパク質であることを見出すことができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
令和3年度における研究で、当初の予定通り、実験材料であるHvSRIおよびHvSRIIのタンパク質試料を安定に得るための方法の確立とそれぞれのタンパク質の光化学的性質を中心とした基本的な性質について調べることができた。そのため、前年度で得られたこれらの情報をもとに、令和4年度では、さらに両タンパク質の変異体を用いた解析へとスムーズに移行できる状況にあるため。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和4年度は、前年度で調べた野生型HvSRI、HvSRIIの光化学的性質をもとに、それらの性質に影響を及ぼすアミノ酸残基置換体の探索を進める。まずは、HvSRIIを鋳型に、ロドプシン様タンパク質全般に高度に保存されていて、重要残基が多く位置するレチナール結合ポケット内のアミノ酸残基をHvSRIの対応するアミノ酸に部位特異的に置換した変異体（HvSRII型→HvSRI型）を作製し、その影響について調べる。また、その逆のパターン（HvSRI型→HvSRII型）についても調べる。さらに、高度好塩菌でのセンサー-トランスデューサー複合体（SRI-HtrI複合体およびSRII-HtrII複合体）の発現系を構築すべく、2種類のトランスデューサーHvHtrI、HvHtrIIの全長のクローニングも試み、それらとセンサータンパク質HvSRI、HvSRIIをそれぞれ共発現させた細胞の構築を試みる。この発現系構築に成功したら、高度好塩菌でのセンサー-トランスデューサー発現系を用いた走光性解析により、実際の走光性機能に影響を及ぼす変異体の探索を行い、それぞれの走光性機能の違いを決めているアミノ酸残基の特定を目指したい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
令和3年度では、主にSR-Htr複合体を介した光情報伝達システムにおいて、光刺激の入力を担う側の分子であるセンサリーロドプシンSRに注目して実験を進めてきたが、令和4年度では研究の対象をSRからの光情報を受け取る側の分子であるトランスデューサーHtrへと拡張させるために、2種類のHtr（HvHtrI、HvHtrII）の単独発現の構築にも取り組みたい。そのため、色のないこれらのタンパク質の高純度試料を得るために、タンパク質精製のためのクロマトグラフィーシステムを強化すべく、前年度の計上予算の一部を次年度に繰り越し、その備品購入などの費用に充てたい。また、令和4年度は多数の変異体タンパク質を作製する予定のため、そのためのプライマー作製に必要なオリゴDNA合成費用にも充てたい。
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