| 研究課題/領域番号 |
21K06112
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
大岡 宏造 大阪大学, 理学研究科, 准教授 (30201966)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 光合成 / 反応中心 / 電子移動 / キノン / 超高速分光 / NMR / ヘリオバクテリア / 緑色イオウ細菌 |
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| 研究実績の概要 |
１．超高速分光による過渡吸収変化の測定
ヘリオバクテリア反応中心の色素間励起エネルギー移動および初期電荷分離形成までの反応過程を追跡し、始原型光合成反応におけるエネルギー変換過程を解明することを目的として行った。手法としてフェムト秒ポンプ・プローブ測定による超高速分光法を用いた。ヘリオバクテリア反応中心のサンプルに10 mM ジチオナイトを加え、エネルギー移動および初期電荷分離状態（P800+A0－）の形成過程までを調べることにした。これまで室温にて810 nm励起後のBChl g間のエネルギー移動を詳細に解析してきたが、今年度は低温140Kにて490 nmで励起することにした。これにより、ヘリオバクテリア反応中心内に対称的に配置されたカロテノイド4,4’-diaponeurosporene（Car）を選択的に励起することができた。グローバル解析の結果，Carの第二励起状態（S2）および第一励起状態（S1）からアンテナBChl gへの励起エネルギー移動が高効率で起こり，電荷分離形成に至ることを初めて明らかにした。
２．ヘリオバクテリア反応中心と電子供与体PetJタンパク質の相互作用解析
ヘリオバクテリア反応中心 には電子供与体としてPetJ（シトクロムc-553）が働いているが、精製過程で容易にはずれてしまう。反応中心とPetJとの共結晶化を試みたが成功しなかった。PetJは反応中心のスペシャルペア側であるP-sideの中央付近で相互作用すると推測されるが、両者の表面電荷の分布状況を調べても相互作用できるほどの特徴的な電荷を見つけることはできなかった。共結晶化に成功しなかったのは、電荷的相互作用が弱いことに起因すると考えられた。そこでクライオ電子顕微鏡による反応中心とPetJの会合体解析を行うことにした。しかしながら期待された会合体は全体の約3%しか存在しなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
100フェムト秒ポンプ・プローブ分光法による超高速分光では、カロテノイドの選択的励起に成功し、カロテノイドからアンテナBChl gへの励起エネルギー移動が高効率で生じ、電荷分離過程に至ることを実験的に確認することができたことは成果として非常に大きい。さらにこれに伴い，Carのphotochromic-band shiftの観測にも成功している．この結果は，カロテノイドの近くに長波長吸収帯を構成するBmd812とBmd787のBChl g集団が存在し，P800にエネルギーを渡すアンテナ色素として機能していることを示している。
またヘリオバクテリア反応中心と電子供与体PetJタンパク質の相互作用解析については、共結晶化による構造解析には至らなかったものの、クライオ電子顕微鏡による会合体解析を推し進めることができたことは大きい。解析標品中の会合体比率が小さいという結果であったが、条件を変えることにより、比率を高めることは十分に可能であると期待される。
このように、本研究目的である「光合成細菌のもつタイプ１反応中心の分子構築と反応機構の全容解明」に向けて、多く弾みがつく研究成果が得られた。
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| 今後の研究の推進方策 |
ヘリオバクテリア反応中心の超高速分光によるエネルギー移動および電子移動過程の解析は非常に順調に進んでいる。カロテノイドからアンテナBChl gへの高効率の励起エネルギー移動に関しては、令和4年度前半にデータをまとめて投稿予定である。補足データとして、ヘリオバクテリア反応中心内の色素配置とエネルギー移動の議論を深める必要があり、770nm励起後の過渡吸収変化を早急に測定することにしている。以前から議論が続いている最長波長red-BChl gsとカロテノイドの空間的位置関係に関する分光データの取得を目指す。
またヘリオバクテリア反応中心の構造解析についてはPshBおよびPetJサブユニットとの共結晶化およびクライオ電子顕微鏡による複合体解析に向けたデータ収集の最終段階にさしかかっている。特に反応中心とPetJサブユニットとの会合体解析については観察条件を改良し、再度、クライオ電子顕微鏡による解析をおこなうことにしている。これに関しても今年度前半にデータをまとめ、投稿用のドラフト作成を予定している。
最後にフーリエ変換赤外分光法（FTIR）によるキノール生成の検出についても、今年度後半あたりから取り組む予定をしている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
備品として薬用冷蔵ショーケースを購入予定であったが、私自身の大阪大学内での所属異動に伴い、設置場所を年度内に決めることができず、令和4年度購入に変更した。サブマイクロ秒からミリ秒の時間領域の測定に必要な密閉型のspinning cellの製作も令和4年度に行うことにした。また令和3年度は新型コロナ感染症拡大の影響もあり、形質転換系の確立に必要な消耗品を購入する必要もなかった。その代わり超高速分光測定に専念したので、大量の標品調製に必要な界面活性剤や精製用Ni樹脂の購入をしなかった。これらの理由により、令和3年度の研究成果そのものは良好であったが、令和4年度の使用額が生じた。
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