2021 年度実施状況報告書

プロテアーゼによる密着結合の恒常性維持機構の解明

研究課題

研究課題/領域番号	21K06156
研究機関	福島県立医科大学
研究代表者	東智仁福島県立医科大学, 医学部, 准教授 (70515072)
研究期間 (年度)	2021-04-01 – 2024-03-31
キーワード	タイトジャンクション
研究実績の概要	タイトジャンクションは、上皮細胞の傍細胞経路の物質透過性を制御し、上皮のバリア機能の維持に貢献している。タイトジャンクションは上皮張力の変化や細胞の変形などにともなって再構成される必要があるが、そうした際にバリア機能を保ち続ける仕組みはこれまでほとんど理解されてこなかった。再構成の際には新規のタイトジャンクションの形成を伴うことが予測されることから、新規タイトジャンクション形成を惹起することが知られているプロテアーゼに着目して研究を進めた。上皮培養細胞株であるMDCK II細胞を用いて、発現している膜繋留型セリンプロテアーゼ４種類全てを欠損した４重ノックアウト細胞を樹立した。４重ノックアウト細胞はバリア機能が大きく損なわれており、上皮恒常性におけるプロテアーゼの重要性を示すことができた。また、セリンプロテアーゼの基質として、接着分子EpCAMを同定した。EpCAMの切断は、４重ノックアウト細胞ではほとんど起きていないことがわかった。さらに、EpCAMが結合する相手として、タイトジャンクション構成分子のクローディン７を見出した。EpCAMはクローディン７と複合体を形成し、未重合の状態でバソラテラル膜上に保持されていることが分かった。アルファフォールド２を用いた構造予測により、プロテアーゼによる切断がEpCAMからクローディン７を解離させて重合可能にすることが推測された。タイトジャンクションの破綻を検出できるイメージングを行い、そうした部位ではクローディン７が不溶化していることを見出した。生化学データとイメージングの結果を元に、EpCAMとプロテアーゼがタイトジャンクションに生ずる微細な破綻を感知し、修復する機構として働くというモデルを提唱し、現在、論文投稿中である。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 1: 当初の計画以上に進展している理由計画していた研究内容の多くを実行し、論文の初投稿まで達成できた。また、当初の計画にはなかったアイデア（界面活性剤を用いて重合クローディンを検出する）でさらにデータの信頼性を高めることができた。
今後の研究の推進方策	投稿した論文が採択されるよう努力する。今回の研究で、三細胞間タイトジャンクションではニ細胞間とは異なる仕組みでタイトジャンクションが維持されていることを示唆するデータを得た。両者の関わりについて研究を進めたい。また、発展した課題として、タイトジャンクションの接着構造の量を一定に保つ仕組みについても遺伝子ノックアウトの手法を活用して探っていきたいと考えている。
次年度使用額が生じた理由	本年度は新型コロナウイルス流行のため、現地開催の学会に参加することができなかった。そのため、旅費として計上した予算を消費しなかった。次年度は、流行状況を鑑みつつ、積極的に学会に参加することを予定している。本年度の繰越分は、円安のために増加している論文投稿費用にあてる予定である。