| 研究課題/領域番号 |
21K06166
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| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
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研究代表者 |
鈴木 博視 東京医科歯科大学, 高等研究院, 特任准教授 (50635472)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | シグナル伝達 / 一回膜貫通型蛋白質 / GTPase / クライオ電子顕微鏡 / 単粒子解析 |
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| 研究実績の概要 |
非常に柔軟性の高い全体構造をとるヒトセマフォリン・プレキシン複合体について、一回膜貫通タンパク質クライオ電子顕微鏡に適した試料作製法の検討を継続して続けた。主に、複数種のサブタイプについて追加のクローニングを行うとともに、発現量の向上が見られる発現細胞種（特に糖鎖付加のパターンが異なるHEK293の変異株など）、発現手法（一過性およびバキュロウイルス系）を検討した。そのうち、Expi293細胞株を使用することで多くのケースにおいて発現量の増加が見られた。発現量が少ないものについては低収量ながら純度を高められるようタグの検討も行った。これらの検討は主にゲル濾過クロマトグラフィーのチャートの高さや単分散性を指標にした。ショウジョウバエ由来遺伝子のサブタイプについて、プレキシンとセマフォリンの組み合わせによって親和性が大きく異なることが分かったため、特に親和性の高い組み合わせのサブタイプについて発現・精製の最適化をおこなった。クライオ電子顕微鏡の試料作製に関しては、脂質ナノディスク再構成系では必要なタンパク質濃度を抑えられる利点があったが、粒子の配向性に偏りが生じがちで三次元再構成が困難という問題が残るため、再構成条件やグリッド作製条件の検討を継続している。界面活性剤によるミセル中では、プレキシン二量体の安定性に問題が残るとともに、電顕グリッド中での粒子数が激減し分散が悪くなる傾向があるため、できるだけタンパク質試料が高濃度になる精製条件を、発現最適化とともに継続している。また、リポソームのような脂質環境に多数のプレキシン複合体が埋め込まれた試料作製条件も検討した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
クライオ電子顕微鏡撮影に適した受容体-リガンド複合体の試料調整の検討を続けており、高分解能での立体再構成が可能な条件にまだ至ってないが、候補分子の展開など進捗の前進が見られる。
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| 今後の研究の推進方策 |
ヒトセマフォリン・プレキシン複合体のクライオ電子顕微鏡撮影に適した試料の最適化をおこなう。脂質ナノディスク法とともに界面活性剤条件下でも撮影可能な、安定で高濃度の試料調整を進める。また大規模データ収集のための電顕のセットアップを進める。
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