| 研究課題/領域番号 |
21K06169
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
田端 桂介 大阪大学, 生命機能研究科, 助教 (40569018)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | Rubicon / 結合タンパク質 / プロテオーム / siRNAスクリーニング / 翻訳後修飾 |
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| 研究実績の概要 |
細胞内分解機構であるオートファジーは、栄養・エネルギー確保の他、細胞内不要物・異物の除去を通じて、癌、生活習慣病、老化など様々な疾患や現象に関わることが知られている。そのオートファジーを制御する因子として、我々は2009年にRubiconを発見し、細胞内の機能解析およびRubiconの生理的役割を明らかにしてきた。しかしながら、肝心な問いであるRubiconがどのようにオートファジーを制御しているか未だよくわかっていない。既知の酵素活性を持たないRubiconの機能を解明するには、Rubiconが協調してはたらく因子の同定が必須であると考えられる。
そこで2021年度には新規Rubicon結合タンパク質の同定を目指し、アフィニティー精製と質量分析を行った。さらにRubiconと結合が検出された因子について、オートファジーにおける役割を検討するため、siRNAを用いた遺伝子発現抑制によるオートファジーへの影響を、当研究室で開発したtandem fluorescent-LC3 (tfLC3; mRFP-EGFP-LC3)を安定に発現するHeLa細胞を用いて調べた。また、オートファジー誘導の有無におけるRubiconタンパク質の翻訳後修飾を調べるため、Rubiconを精製し、質量分析によりタンパク質修飾を調べた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
2021年度は、結合タンパク質の探索や翻訳後修飾解析のために質量分析を行い、その後siRNAスクリーニングによる候補の絞り込みを行い、研究計画は順調に進展している。現在、得られた候補因子のオートファジーにおける役割を明らかにするため機能解析を行なっている。
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| 今後の研究の推進方策 |
候補因子のオートファジーにおける役割の解析に向けて、まず内在性の候補因子がRubiconと実際に結合することを免疫沈降法により確認する。また培養細胞を免疫染色することにより細胞内共局在をオートファジー誘導有無の条件で確認する。Rubiconと結合、共局在の認められる因子において、さらなる機能解析を行う。具体的には各候補が有している既知の機能がオートファジー誘導下においてRubiconによって制御される可能性を検証する。Rubiconの翻訳後修飾の重要性については、作成した変異体を野生型と比べて、オートファジーにおける修飾の重要性を検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究は計画通りに進んでいるが、初年度に想定していた試薬等の物品購入を見送ったため次年度使用額が発生した。試薬等には使用期限があるため、次年度以降の適切な時期に購入費用に充てる予定である。
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