| 研究課題/領域番号 |
21K06170
|
|---|
| 研究機関 | 大阪大学 |
|---|
研究代表者 |
荒木 保弘 大阪大学, 大学院歯学研究科, 助教 (60345254)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
|
| キーワード | TORC1 / Pib2経路 / 酵母 / アミノ酸 / システイン |
|---|
| 研究実績の概要 |
細胞は栄養源を感知して、細胞の増殖と成長を厳密に制御している。この情報はTORC1に集約され、このリン酸化酵素活性のオンオフに転換される。TORC1は多岐にわたる栄養源の中でもアミノ酸に対してよく反応する。細胞が20種ものアミノ酸をどのように認識し、TORC1を活性化するかは最大の未解決問題である。酵母を用いた遺伝学的解析から申請者は新規TORC1活性化経路としてPib2経路を見出し、既知のGtr/Ego経路及び新規Pib2経路の二経路のみがTORC1活性化経路として機能することを報告してきた。本研究課題ではこれまでに20種のアミノ酸それぞれがGtr経路とPib2経路のどちらを介してTORC1を活性化するのかを検証し、二つの経路は応答するアミノ酸に違いがあることが明らかにしている。この成果をもとに今年度は新規Pib2経路の分子機序の解明を目的に以下の三点を明らかにした。第一にPib2経路のみを経由するアミノ酸であるシステインを添加するとTORC1-Pib2間の相互作用がin vivoとin vitroの両者で亢進しTORC1を活性化すること、第二にシステインに呼応するTORC1-Pib2間相互作用の亢進には既知のTORC1結合領域に加えて新規な高保存領域が必要であること、第三にPib2がアイソトープで標識したシステインへ直接結合することを見出した。これらはPib2がシステインを直接感知し、TORC1へその存在を伝えるシステインセンサーであることを強く示唆する。アミノ酸センサーは哺乳細胞において少数のアミノ酸について先駆的研究がなされているが、これらは種間で保存されておらず、酵母においてアミノ酸センサーの知見は皆無である。本研究により、TORC1活性化の分子機構、特に多様なアミノ酸センシング機構の理解が種を超えて大きく進むものと考える。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
細胞の成長と増殖を司るTORC1はアミノ酸により自身の持つリン酸化酵素活性を活性化する。TORC1の活性化経路としてGtr/Ego経路及びPib2経路の二経路が見出されている。更にTORC1活性化経路はGtr/Ego経路とPib2経路の二経路しか存在しないことから、全てのアミノ酸はこの二経路を経由していると考えられる。Pib2経路の活性制御の解明は“アミノ酸がどのようにTORC1を活性化するのか”という最も重要な課題に通じると考える。申請者は、SCF-Das1ユビキチンライゲースがPib2経路を正に制御する因子を分解し、Pib2経路をネガティブに制御しているという新たな仮説に基づき、Pib2経路に強く依存するシステインを用い、SCF-Das1の標的因子の探索を行った。その過程で精製標品を用いた試験管内TORC1-Pib2間相互作用の再構成実験においてシステインの添加が増強することを見出し、さらにTORC1構成因子またはPib2がシステインと直接結合する可能性を検証した。その結果、Pib2がシステインへ直接結合することが判明した。以上からPib2がシステインを直接感知し、TORC1へその存在を伝えるシステインセンサーであるという新たな仮説に至った。アミノ酸センサーは哺乳細胞において少数のアミノ酸について先駆的研究がなされているが、これらは種間で保存されておらず、酵母においてアミノ酸センサーの知見は皆無である。本研究により、TORC1活性化の分子機構、特に多様なアミノ酸センシング機構の理解が種を超えて大きく進むものと考える。
|
| 今後の研究の推進方策 |
SCF-Das1ユビキチンライゲースを中心に据え、その標的因子からアミノ酸センサーを同定することを当初の目的としていた。しかしPib2がアミノ酸センサーであることを強く示唆する今年度の成果をもとに以下の点を明らかにする。① Pib2はどのようにシステインを認識するのか。② Pib2はシステイン以外のアミノ酸も認識できるのか。① Pib2がアイソトープで標識したシステインへ直接結合することに加え、システインに呼応するTORC1-Pib2間相互作用の亢進には既知のTORC1結合領域と機能未知な高保存領域が必要であることを見出している。Pib2のシステイン結合様式の詳細を明らかにすることを目的に、各残基をアラニンに変換した変異体を用い、システイン結合能への影響を検証する。これにより、システインの認識に必要な残基を同定し、さらにこの変異体を有する酵母変異株がシステインに呼応しないことを確認する。② 20種のアミノ酸がGtr経路に強く依存する9種、Pib2経路に強く依存する6種（Pib2経路特異的アミノ酸）、両方の経路が関与する5種の3つに分類されることを明らかにしている。Pib2がシステイン以外の5種のPib2経路特異的アミノ酸を直接認識できるのかを検証する。試験管内結合実験に使用していたアイソトープ標識のアミノ酸が非常に高価であることから、安価でより検出感度の高い等温滴定型カロリメトリー（ＩＴＣ）を用いる。装置自身は高価であるので購入せずに大阪大学理学部にて稼働している共同利用ＩＴＣを使用する。これまで哺乳細胞において単離されたアミノ酸センサーは全て一つのアミノ酸しか認識できず、アミノ酸とセンサーは一対一対応しているというドグマが流布している。Pib2が複数のアミノ酸を認識すれば、このドグマを一変する知見となりうる。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度もコロナ禍のため、出席を予定していた学会や研究会への参加をキャンセルしただけでなく、共同研究の打ち合わせもオンラインとしたため、計上していた国内及び海学会参加費、共同研究先訪問費を使用しなかった。以上は翌年度の国内外学会参加費、論文出版経費として持ち越す。また、昨今の物価上昇を鑑み、試薬や消耗品全てを見直し、少々の質の低下はあってもより安価な物へ移行を実施した。その結果、経費削減となった。これを基金として翌年度に持ち越し、研究に必要な試薬や消耗品経費として使用することとした。
|
