| 研究課題/領域番号 |
21K06171
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
梶保 博昭 神戸大学, 医学研究科, 講師 (70401221)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 小胞体 / ユビキチン |
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| 研究実績の概要 |
飢餓状態の細胞は自らの脂質やタンパク質を分解して栄養供給や新陳代謝を行っている。特に小胞体の一部を選択的に分解する現象はERファジーと呼ばれている。飢餓状態から栄養状態が回復してERファジーが終結するためには、ERファジーに関わるタンパク質を速やかに分解する必要があるがその分子機構はわかっていない。
小胞体でのタンパク質の分解経路の一つにユビキチン－プロテアソーム系が知られている。近年、小胞体に局在するユビキチンリガーゼの一つがERファジーに必要であることが報告され、ERファジーがユビキチン化反応によって調節される可能性が示唆された。私はERファジーに関わるタンパク質がユビキチン化され分解されることで、ERファジーを速やかに終結させると考えた。本年度はER-ファジーに関わるタンパク質のユビキチン化反応について調べ、以下の結果を得た。
1）小胞体に局在するタンパク質で、ユビキチンリガーゼを持つことが報告されているlunaparkがERファジーに関わる約63kDaの膜タンパク質(p63)をユビキチン化することを見出した。
2）Lunaparkをノックダウンした培養細胞では、プロテアソームによるp63の分解が減少することを見出した。
このように本年度は、ユビキチン反応によりERファジーが終結する分子機構について当初の計画とおりの成果をあげることができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ERファジーに関わるタンパク質p63が、小胞体に局在するユビキチンリガーゼ活性を持つタンパク質lunaparkによってユビキチン化されることを見出した。また、lunaparkをノックダウンした培養細胞ではp63のプロテアソームによる分解が減少した。これらの結果より、lunaparkがp63をユビキチン化して分解することにより、ERファジーの終結反応を調節している可能性が示された。ユビキチン化反応によりERファジーが終結する分子機構を明らかにするという本研究課題の目的に対して、おおむね順調に研究が進展した。
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| 今後の研究の推進方策 |
1)ERファジーに関わるタンパク質p63のERファジー終結時のユビキチン化；p63が飢餓状態から栄養状態の回復に伴いユビキチン化されているかを調べる。mycタグを付与したERファジーに関わるタンパク質とHA-ユビキチンをCOS-7細胞に発現させ飢餓培地で培養した後に血清培地で培養する。抗myc抗体による免疫沈降画分を抗HA抗体でイムノブロットしユビキチン化を示すラダー状のバンドを検出する。血清培地に交換してERファジーが終結すると考えられる時間帯にユビキチン化が増加しているかを調べる。
2)ERファジーに関わるタンパク質のユビキチンリガーゼの探索
2-1 ユビキチンリガーゼの探索；飢餓状態から栄養状態が回復する際にERファジーに関わるタンパク質をユビキチン化するlunapark以外のユビキチンリガーゼを探索する。mycタグを付与したERファジーに関わるタンパク質とHA-ユビキチンをCOS-7細胞に発現させ飢餓培地で培養した後に血清培地で培養する。抗myc抗体による免疫沈降画分をさらに抗HA抗体によって免疫沈降し、SDS-PAGE後に銀染色を行う。血清培地に交換した細胞からのサンプルのみに含まれるタンパク質を質量分析器により同定する。
2-2 基質のユビキチン化部位の同定；同定した基質の様々なN末およびC末の欠失変異体を用いin vitroユビキチン化アッセイを行い、ユビキチン化領域を限定する。この領域内のリジンをアルギニンに置換した変異体を作成しin vitroユビキチン化アッセイを行い、ユビキチン化部位を決定する。
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