| 研究課題/領域番号 |
21K06211
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| 研究機関 | 新潟大学 |
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研究代表者 |
酒井 達也 新潟大学, 自然科学系, 教授 (10360554)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 光環境応答 / フォトトロピン / 光屈性 / NPH3 / リン酸化 |
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| 研究実績の概要 |
植物の芽生えは地上部を光源方向に向かって成長させる光屈性を示す。シロイヌナズナ黄化芽生え胚軸の場合、ヒトの視覚と同程度の光感受性を示し、９桁に及ぶ光強度の異る環境下であっても同じように光屈性応答が誘導される。このような光環境応答においては、光が弱いときには光感受性を高め、逆に光が強いときには光感受性を下げる、高度な光順応機構が必要と考えられる。我々は、光屈性に必須の働きを示すシグナル伝達因子 NPH3 のリン酸化修飾調節が、シグナル伝達因子レベルの光順応機構を生み出すことを発見した。2021年度、本研究成果をまとめ、Plant Physiology誌及びPlant Signaling Behavior 誌で発表することができた。
実験計画に沿い、NPH3 脂質修飾変異体発現体、NPH3天然変性ドメイン欠失変異体を作出し、その表現型を観察中である。またYFP融合変異体も同時に作成し、表現型を観察中である。少なくとも NPH3 天然変性ドメインのほとんどが NPH3 機能に必須ではないことが示唆される結果を得た。NPH3リン酸化調節に働く新奇因子同定のための phot1 エンハンサー変異体選抜は、候補株は複数単離したものの、リン酸化修飾異常の変異体は単離できなかった。phot1自己リン酸化がNPH3細胞内局在調節に与える影響を調べるため、PHOT1自己リン酸化修飾ができない変異体を作成した。現在その表現型を観察中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
光照射による NPH3 の細胞膜からの解離がおきないように NPH3 の N 末もしくは C 末に脂質修飾（ミリストイル化、ファルネシル化）をうけるアミノ酸配列を融合し、これを nph3 変異体内で発現した形質転換体の光屈性を観察することによって検証した。C末端のアミノ酸付与はNPH3 の機能を阻害することが明らかとなり、脂質修飾による機能変化の有無は検証できなかった。N 末端のアミノ酸付与、脂質修飾による機能変化の有無については現在検証中である。
NPH3凝集体形成に働くリン酸化修飾がタンパク質の天然変性ドメインでおきていることから、これらの領域を破壊した nph3 突然変異体を作成し、光屈性応答を観察した。興味深いことに、複数箇所に渡って存在する天然変性ドメインのほぼすべてを欠失した NPH3 変異体においても、NPH3 の機能は維持されることが示唆された（未発表）。ｐhot1 自己リン酸化が NPH3 細胞内局在調節に働く可能性を検討するため、PHOT1リン酸化部位をすべてアラニン置換した突然変異体を作出し、その表現型を観察している。
phot1 エンハンサー変異体選抜からの NPH3 リン酸化酵素同定を試みたが、phot2、nph3 変異体は選抜されたものの、NPH3リン酸化修飾に変化を与える突然変異体は選抜できなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
NPH3 天然変性ドメインの機能解析をさらにすすめる。形質転換株確立後、光屈性応答、特に光感受性について詳細な解析を行う。また天然変性ドメイン欠失の度合いが細胞内局在にどのような影響を与えるか、YFP融合タンパク質の細胞内局在観察から明らかにする。NPH3 が細胞質凝集体形成なしに光屈性誘導に働く可能性を明らかにする。天然変性ドメイン欠失NPH3 が光屈性誘導に働くことが可能な場合、YFP融合天然変性ドメイン欠失NPH3の免疫沈降により、そこに結合する光屈性シグナル伝達因子の同定を試みる。
ミリストイル化修飾ドメイン融合NPH3 の機能及び細胞内局在解析をすすめ、NPH3細胞質遊離の光屈性における意義を明らかにする。
PHOT1 自己リン酸化部位がすべてアラニン置換した phot1 変異体の表現型及び、この変異体でのNPH3 の細胞内局在及びリン酸化修飾の異常の有無について検証し、PHOT1ーNPH３ 相互作用における PHOT1 自己リン酸化の意義を明らかにする。
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