| 研究課題/領域番号 |
21K06226
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
奥田 哲弘 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 助教 (90727702)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 受容体 / シグナル伝達 / シゾン / タンパク質発現 / バキュロウィルス-カイコ幼虫 |
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| 研究実績の概要 |
植物は、独自の細胞膜受容体タンパク質を数多く持ち、外界からのシグナル分子を受容・応答する細胞内情報伝達機構を確立することで、生息環境へと適応してきた。高等植物は、主に Leucine-rich repeats (LRR) 受容体ファミリーを用いて多様なシグナルを受容する。本研究では、単細胞紅藻シゾンがもつ、(1)単一LRR受容体のタンパク質機能と構造の解明、(2)受容体-リガンドが制御する細胞内情報伝達機構の解明、(3)シグナル伝達ダイナミクスの解明を目的とする。本年度は、LRR受容体の立体構造解析に向けた、タンパク質の発現・精製方法の検討を行った。検討の結果、バキュロウィルス-カイコ幼虫タンパク質発現系を用いて、タンパク質結晶化スクリーニングに十分な品質のタンパク質を得た。今後は、タンパク質結晶化スクリーニングに取り組むととともに、電子顕微鏡単粒子解析試料の調整方法の検討を行っていく予定である。そして、これまでにリストアップした共役受容体候補タンパク質とのin vitroタンパク質間相互作用解析に向けて、タンパク質試料の調整方法の検討を行った。同時に、in vivoタンパク質間相互作用解析、細胞内相互作用因子の単離・同定のために、タグ融合株の作出を進めた。また、LRR受容体タンパク質のシグナル伝達ダイナミクスを解析するために、LRR受容体に加えて、共役受容体候補タンパク質である複数の細胞膜タンパク質の蛍光タンパク質タグ導入株の作出を進めた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
LRR受容体の遺伝子ノックアウト株、発現誘導・抑制株の作出に遅れがみられ、in vivo機能解析の遅延が生じた。一方で、LRR受容体細胞外ドメインの組換えタンパク質の発現・精製方法の検討を予定通りに進め、結晶化スクリーニング、電子顕微鏡解析試料の調整に向けた準備が整っている。そして、共役受容体候補タンパク質の生化学的スクリーニングにむけたタンパク質試料の調整法の知見も得られた。また、LRR受容体を中心とした細胞膜タンパク質群の蛍光タンパク質タグ導入株の作出は進んでいることから、次年度に局在解析を進める準備はできたと考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
シゾンがもつ単一LRR受容体は複数のドメインをもつことから、タンパク質立体構造解析に加えて、in vivo機能解析も詳細に調べていくことで、構造と機能の関連性を明らかにする。蛍光タンパク質タグ導入株の局在解析により、LRR受容体のシグナル伝達ダイナミクスも調べていく。また、in vitro, in vivoにおけるタンパク質間相互作用解析により、LRR受容体に対する共役受容体、細胞内相互作用因子の同定を目指す。以上の解析を通じて、LRR受容体の構造と分子ダイナミクスの知見を統合し、シグナル伝達の分子作用機序の解明を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
所属研究室における機器移入に伴い、計画していた一体型低圧クロマトグラフィーシステム、低温恒温培養器の購入予定が変更となった。次年度では、タンパク質結晶化スクリーニング、in vitroタンパク質間相互作用解析にむけた消耗品の購入費用が必要になると見込んだため、予算の一部を繰り越した。
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