| 研究課題/領域番号 |
21K06271
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| 研究機関 | 杏林大学 |
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研究代表者 |
田中 浩輔 杏林大学, 保健学部, 教授 (50236585)
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| 研究分担者 |
伊藤 慎 杏林大学, 保健学部, 講師 (00460139)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 甲殻類 / RNAseq / トランスクリプトーム解析 / モノアミン受容体 |
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| 研究実績の概要 |
甲殻類の自律運動器官の自動性の源を調べるため、クルマエビ成体の心臓や腸管を用い自動性の発現機構を明らかにすることを目的として分子生物学的アプローチによる研究を主に進めた。
昨年度までに収集した基礎データの解析を進めた。具体的には、クルマエビ成体を用いてターゲットとなる自立運動器官を含む代表的ないくつかの部位（心臓、消化管、筋肉、中枢神経系）より抽出したtotal RNAを混合したサンプルについて、RNAseq解析を行った。これらのアノテーション情報を付加したデータに関して、心臓の自律運動に関与しているHCN channel及び自律神経系に深く関与しているモノアミン関連の受容体について解析を行った。
HCN channelに関しては、４つのトランスクリプトームがそれぞれ、Tribolium castaneum 2種類, Hyalella azteca, Penaeus vannameiらの動物種に対して一致度78％以上で高いホモロジーを持つことが示唆された。今後、これらの情報を元に保存性が高い配列を検討し、クローニング及び発現部位について検討を行う。また、心筋や腸管を構成する筋の活動を修飾するモノアミン類に関するレセプターについては、オクトパミン、ドーパミンおよびセロトニンのレセプターとみられるトランスクリプトーム情報で、既存のデータベースに対して高いホモロジーを持つことが示唆された。これらのうちDopamine like receptor2及びOctopamine receptor Beta-2R likeそれぞれについて、RT-PCRにより解析を行ったところ、ドーパミン様レセプターに関しては、腸において、強い発現が観察された。一方、オクトパミン様レセプターに関しては、中枢、筋肉、心臓にて発現が観察された事から、少なくとも、生体内に発現している事が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
分子生物学的手法を用いた解析に関しては、RNAseqによるmRNAライブラリーから、既存の無脊椎動物の遺伝情報と これまでの神経伝達物質の受容器に加え、ターゲットの1つのcation channelの遺伝子配列との比較するBLAST検索を行ったが、in situ hybridization などにより発現部位の詳細な特定などがまだできておらず、やや遅れている。
一方、生理学的手法に関しては、心筋および腸管構成筋に対して薬理学的及び電気生理学的特徴を調べる実験を試みたが、細胞内通電による筋原性反応の惹起ができず、テトロドトキシン投与下で筋の薬理特性を確定するに至らなかった。特に腸管の組織標本監察の結果腸管の筋層厚さが薄いことはわかり、細胞内誘導法を用いた薬理学的実験にさらなる工夫の必要性が生じている。今後、イオン濃度を変化させる等の手法により自律運動を構成する筋の性質を引き続き明らかに必要がある。したがって、総合的に遅れていると評価した。
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| 今後の研究の推進方策 |
HCN channelに関しては、４つのトランスクリプトームがそれぞれ、Tribolium castaneum 2種類, Hyalella azteca, Penaeus vannameiらの動物種に対して一致度78％以上で高いホモロジーを持つことが示唆されたことから、今後、これらの情報を元に保存性が高い配列を検討し、クローニング及び発現部位について検討を行う。ただし、上記4つの元となるトランスクリプトーム情報については、クローニングされたものではない事から、慎重に解析を行う必要がある。今後は、他の候補トランスクリプトームについても具体的な解析、クローニング、In situ hybridizationによる組織学的解析などを行う。
次に、腸管からの細胞内誘導法を確立させ、薬理学的に惹起される自律運動の起こすイオンメカニズムをイオン濃度の変化、通電による応答性などを調べ詳しい特徴づけを行う。
また、神経原性はニューロンの出現と対応するので、クルマエビを用いた幼生における、形態の変化を組織学的に調べ、特に個体発生過程上の特定の時期（プロトゾエア期～ポストラーバ期初期）ニューロンの出現の有無を調べる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
２２年度はデータ解析用コンピュータを購入し、またデータ整理補助の謝金支払い、および実験消耗品購入したが、残金が発生した。該当予算に関しては、さらなるデータ解析に使用する予定である。
また、電気生理学的手法で予定していた結果の確定が進まなかったため、年度内に使用薬品の購入および一部用品の購入が実施できなかった。一部を組織学的研究に変更し進めるための顕微鏡カメラ関連品の購入に使用したが、予算全額の執行には至らなかった。しかし、次年度は筋への薬理学的実験を改良し実施予定であることから、その生理活性物質の受容体アゴニストやアンタゴニストをはじめとする関連薬物を新規購入する必要性が生じた。また、組織学的実験の比率を高める必要性が称したことから、22年度の未使用の予算を執行する予定である。
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