| 研究課題/領域番号 |
21K06280
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| 研究機関 | 学習院大学 |
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研究代表者 |
菱田 卓 学習院大学, 理学部, 教授 (60335388)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | DNA二本鎖切断 / DNA相同組換え / 大腸菌 |
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| 研究実績の概要 |
DNA二本鎖切断(DSB)の修復には、切断部位周辺の染色体構造を安定に維持し無傷の姉妹染色体との相互作用を促進する染色体レベルの空間的な制御が重要である。しかしながら、大腸菌には姉妹染色体をつなぎとめるコヒーシンに相当するSMCタンパク質が存在しないため、その分子機構は未だ不明である。本研究は、DNA損傷依存的に発現するSMCタンパク質であるRecNのDSB修復における役割を詳細に解析し、DNA鎖間の空間的制御とDSB修復促進のメカニズムを明らかにする。これまでに、我々は、MMC（マイトマイシンC）処理により核様体の断片化が観察されたrecN欠損細胞において、MMC処理後90分の段階からアラビノース誘導系を使ってRecNを発現させると、生存率および核様体構造が野生型レベルまで回復することを見出しており、iRFNと命名している。本研究では、「RecNが細胞内で断片化した核様体をどのようにして再構築するのか?」という疑問に答えるために、iRFNにおける核様体とGFP-RecNの動態を蛍光顕微鏡を用いて詳細に解析し、さらにそれらに影響を及ぼす変異体の生化学的な機能解析を実施した。その結果、GFP-RecNを発現誘導後、断片化した核様体間にRecNが局在し、その後核様体の接着と再構築が起こることが明らかになった。また、予備実験から得られている多数(>20)のRecN変異体について、DNA損傷後の発現やタンパク質の安定性、核様体への局在等について解析を行なったところ、核様体に局在できない変異体をはじめ、野生型と異なった挙動を示す変異体を複数同定することに成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究は、RecNが持つ核様体構造維持活性がHRにおいて果たす役割を解明し、SMCファミリーによる核様体の空間的制御とHR促進のメカニズムを明らかにすることを目的としている。
１）これまでの研究から、DNAクロスリンク剤(MMC)処理により核様体の断片化が観察されたrecN欠損細胞において、アラビノース誘導系を使ってRecNを発現させると生存率および核様体構造が野生型レベルまで回復することを見出している。今回、我々は、断片化した核様体とRecNの動態解析を進めるため、GFP-RecNを発現誘導することで断片化した核様体を持つ細胞におけるRecNの局在を蛍光顕微鏡を用いて詳細に解析した。その結果、誘導後10分以内にGFP-RecNがドット用の局在（RecNフォーカス）形成を示した。この局在箇所を詳細に調べたところ、核様体上ではなく、断片化した核様体の末端部と核様体間の隙間（インタースペース）に有意に局在していることが示された。さらにその後、核様体の再構築によるインタースペースの解消と共にRecNの局在も消失することがわかった。このインタースペースには、DAPI染色によって薄く紐状で染色されるDNAが確認できるため、断片化した核様体のDSB末端部が存在していると考えられる。そのため、今回得られたRecNフォーカスの結果は、RecNがDSB末端部に局在し、核様体の再構築に関与している過程を観察していると考えられる。
２）MMC高感受性を示すrecN変異体（n>20）を用いて、DNA損傷後の細胞内発現量と安定性についてウエスタンブロット解析により定量解析を行なった。さらに、GFPと融合したRecN変異体を作製し、DNA損傷後の核様体局在について検討を行なった。その結果、野生型RecNと同定度の安定性を示す変異体の中で、核様体への局在に異常が見られた変異体を複数単離することに成功した。
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| 今後の研究の推進方策 |
１）これまでのアラビノースによるGFP-RecN誘導実験（iRFN解析）から、RecNがDSB末端部に局在し、核様体の再構築に関与していることが示唆された。そこで本年度は、これまでの時間ごとのサンプリング実験に代えて、生細胞を用いたRecNの動態ライブ解析を行う。これにより、断片化した大腸菌１細胞に着目し、RecNの局在から断片化の修復までを観察することが可能となるため、RecNの断片化修復の役割をより詳細に解析することが期待できる。これには核様体とGFP-RecNを同時に観察する必要があるため、核様体の観察にはmCherry-HUタンパク質を発現する細胞を用いる。
２）核様体への局在に異常が見られたRecN変異体について、全て精製し生化学的解析を行う。特に、RecNが持つATP加水分解活性、DNA結合及びテザリング活性、RecA鎖交換反応の促進に関して変異体の影響を調べる。さらに、これらの活性に影響が見られたRecN変異体については、iFRN解析を行うことで核様体の再構築との関連性を明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
recN変異体の分子遺伝学的解析の結果をまとめるのに時間がかかったため、今年度予定していたRecN変異タンパク質の精製が次年度にずれ込んだため。 タンパク質の精製に使用する生化学関連試薬及び培地、プラスチックチューブ、アフィニティカラム等の物品費に使用する。
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