| 研究課題/領域番号 |
21K06294
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| 研究機関 | 法政大学 |
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研究代表者 |
豊岡 博子 法政大学, 生命科学部, 助手 (00442997)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | 性フェロモン / ボルボックス系列 / 細胞間コミュニケーション |
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| 研究実績の概要 |
多くの真核生物は有性生殖の際、性フェロモン等の生理活性物質を介した細胞間コミュニケーションシステムを採用しているが、これらのシステムが獲得された過程についての分子進化学的知見は乏しい。本研究は、有性生殖の誘発の要因が、「環境要因（窒素飢餓）」から「性フェロモンを介した細胞間コミュニケーション」に転換した系統群・ボルボックス系列緑藻を用い、その中間段階にあるユードリナを中心とした比較生物学的解析を展開することで、真核生物における生理活性物質を活用した細胞間コミュニケーションシステムの獲得と進化のプロセスを分子レベルで解き明かすことを目的とする。
令和３年度にはまず、ユードリナにおいて性フェロモン活性を検証するためのバイオアッセイ系の再確立を行った。具体的には、既存の雌雄株を交配させ、有性生殖を活発に行う雄株を新たに単離し、この株を用いて条件検討を行うことで、性フェロモンを含む培養上清の投与によって精子束を効率よく誘導できる系を構築した。このユードリナの性フェロモンは糖タンパク質である可能性が考えられたため、糖タンパク質濃縮用樹脂を用いた性フェロモンの回収を試みたが、上記バイオアッセイ系による検証の結果、この樹脂と性フェロモンの結合は検出できなかった。一方、限外濾過カラムを用いて培養上清に含まれるタンパク質全体を濃縮した場合には、性フェロモン活性を確認することできた。そのため今後は、この限外濾過カラムで濃縮した培養上清をゲル濾過クロマトグラフィーにより分画し、上記バイオアッセイ系にて検証することで精子束誘導活性を持つ画分を特定し、この画分に含まれるタンパク質を質量分析することで、ユードリナの性フェロモンタンパク質の分子同定を目指す。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本研究では、ユードリナにおいて有性生殖の誘発の要因となる性フェロモンを分子同定することを目指しており、その達成のためには性フェロモン活性を検証するためのバイオアッセイ系が必須である。しかし令和３年度に、これまで使用していたユードリナ雄株の有性生殖能が著しく低下したため、既存の雌雄株を交配させ、有性生殖を活発に行う雄株を新たに単離した。この株を用いて条件検討を重ね、性フェロモンの存在をモニターできるバイオアッセイ系の再確立に成功した。ユードリナに近縁なボルボックスでは、同様の活性を持つ性フェロモンは糖タンパク質であることが知られているため、ユードリナの性フェロモンも糖タンパク質である可能性が考えられた。そこで糖タンパク質濃縮用樹脂を用いることで、ユードリナの性フェロモンを培養上清から回収することを試みた。しかし上記で確立したバイオアッセイ系を用いて検証した結果、樹脂結合画分には活性がみられなかったため、この樹脂は性フェロモンの回収には不適切であることが判明した。一方、限外濾過カラムを用いて培養上清に含まれるタンパク質全体を濃縮した場合には、性フェロモン活性を確認することできた。
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| 今後の研究の推進方策 |
精子束誘導活性を有するユードリナ雄株由来の細胞外分泌タンパク質を限外濾過カラムで濃縮し、ゲル濾過クロマトグラフィーにより分画する。得られた各画分を令和３年度に確立したバイオアッセイ系にて検証することで、精子束誘導活性を持つ画分を特定する。得られた性フェロモン活性画分に含まれるタンパク質をLC-MS/MS（外部委託）で解析し、性フェロモン候補タンパク質の配列を同定する。得られた候補配列をもとに、大腸菌等を用いて組換えタンパク質を発現させ、その精子束誘導活性を検証することで性フェロモンタンパク質を同定する。
また本研究では、ユードリナの精子束誘導性フェロモンの受容体タンパク質の同定を行う。具体的には、性フェロモンに対する反応性の異なるサンプルからRNAを抽出し、外部委託によって比較トランスクリプトーム解析を行う。その結果から、性フェロモン感受性と相関を示す発現パターンを持つ遺伝子群を抽出し、その中から受容体キナーゼ等、受容体として働きうる構造を持つ候補因子を絞り込む。得られた候補因子については、組み換えタンパク質を作成し、免疫沈降法によって上記で同定した性フェロモンとの相互作用を検証する。さらに、ユードリナで報告例があるパーティクルガン法による遺伝子導入系を用いて機能阻害実験を行い、精子束誘導能の検証を行うことで、当該タンパク質の機能を実証する。
さらに上記解析で得られたユードリナの性フェロモンおよびその受容体タンパク質について、他のゲノム解読済みのボルボックス系列生物に展開して、包括的な解析を行う。
以上の解析によって、性フェロモンおよびその受容体が、どのような分子進化を経た上で誕生したのかを推定することで、生理活性物質を活用した細胞間コミュニケーションの誕生の鍵となる進化プロセスの理解に迫る。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
「研究実績の概要」および「現在までの進捗状況」で述べたように、 令和３年度、これまで使用していたユードリナ雄株の有性生殖能の低下がみられ、新規株を用いた性フェロモンのバイオアッセイ系の再確立に時間を要した。そのため研究計画当初は令和３年度に外部委託にて行うことを予定していた、性フェロモン活性画分に含まれるタンパク質の質量分析が行えなかった。性フェロモンのバイオアッセイ系は、令和３年度末までに再確立できており、同タンパク質の質量分析を令和４年度に行う予定で、そのための予算確保が必要である。
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