| 研究課題/領域番号 |
21K06325
|
|---|
| 研究機関 | 藤田医科大学 |
|---|
研究代表者 |
塚本 健太郎 藤田医科大学, 共同利用研究設備サポートセンター, 講師 (00582818)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
|
| キーワード | プロテアソーム / 種を超えた多型 / 対立遺伝子 |
|---|
| 研究実績の概要 |
遺伝的多型には、複数の生物種にまたがって存在する「種を超えた多型 (TSP)」が知られている。硬骨魚類では、免疫プロテアソームサブユニット遺伝子PSMB8がTSPを示すことが明らかになっている。軟骨魚類と条鰭類のPSMB8遺伝子にはアミノ酸配列で約20%もの違いが認められる二系統（A系統とF系統）が存在し、条鰭類では二型性を示す対立遺伝子として約4億年以上にわたり種をまたがって維持されている。また、肉鰭類と一部の条鰭類では、F系統を失ったのち、A系統からF系統様の対立遺伝子を創り出し、二型性を再獲得していることが示唆されている。
本年度は、再獲得された二型性を有する条鰭類ニホンメダカを用いて、A系統とF系統様の対立遺伝子それぞれからコードされるPSMB8の機能の比較解析を行うため、それらのプロテアーゼ活性を測定するための系を確立した。免疫プロテアソームに含まれるプロテアーゼ活性を有する3種のサブユニット(PSMB8, PSMB9,PSMB10)はインターフェロンγ（IFN-γ）によって発現が誘導される。まず、ニホンメダカのIFN-γ遺伝子を大腸菌に発現させ組換えタンパク質の精製を行い、組換えIFN-γを作製した。A系統またはF系統様の対立遺伝子が固定されている近交系個体それぞれから確立された線維芽細胞様の培養細胞株を用いて組換えIFN-γの効果を調べたところ、添加前にはほとんど検出されなかったPSMB8がIFN-γ添加によって強く発現誘導され、二次元電気泳動と質量分析によりPSMB8,PSMB9,PSMB10を含む免疫プロテアソームだけが形成されていることを確認した。従って、これらの培養細胞を使ってIFN-γ添加前後のPSM8の切断特異性を比較することにより、PSMB8の二型間の切断特異性の違いを検出できると考えられる。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ニホンメダカの培養細胞に組換えIFN-γを添加することにより、PSMB8を含む免疫プロテアソームが発現誘導された。この免疫プロテアソームを精製しプロテアーゼ活性を測定することにより、A系統とF系統様のPSMB8間での切断特異性の比較が行えると考えられる。
|
| 今後の研究の推進方策 |
ニホンメダカの培養細胞から組換えIFN-γにより誘導されたPSMB8を含む免疫プロテアソームを精製し、多種の合成ペプチド基質を用いてPSMB8の二型間の切断特異性を比較する。
PSMB8遺伝子の二型性が脊椎動物の進化過程で少なくとも2回独立に、条鰭類と肉鰭類のある時期に失われたことが示唆されている。そこでこの時期を明確にするため、まず条鰭類と肉鰭類のそれぞれでA系統からのF系統様の獲得が確認されている種より古くに分岐した動物種を対象とし、その野生個体の採集を行い、PCRの鋳型として使用するゲノムDNAの抽出を行う。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
ニホンメダカ培養細胞から組換えIFN-γにより誘導された免疫プロテアソームを精製し、多種の合成ペプチド基質を用いてPSMB8の切断特異性を二型間で比較する予定だったが、本年度中に行えなかったため次年度使用額が発生した。この使用額は、当該実験を行うために次年度に使用する予定である。
|
