| 研究課題/領域番号 |
21K06375
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| 研究機関 | 鹿児島大学 |
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研究代表者 |
原口 みさ子 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 准教授 (10244229)
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| 研究分担者 |
奥野 浩行 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 教授 (80272417)
城山 優治 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 助教 (90456195)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | Zdhhc18 / 遺伝子欠損マウス |
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| 研究実績の概要 |
本研究は新規活動依存的パルミトイル化酵素遺伝子Zdhhc18の神経細胞、マウス個体における機能及び病態への関与の機構を明らかにすることを目的とする。研究実施計画としては令和3年度に①免疫染色により大脳中、あるいは神経細胞中でのZdhhc18の局在解析を行う。②培養神経細胞へのZdhhc18の強制発現による形態変化解析を行う。③大脳発達段階におけるKO神経細胞の形態、伸長の解析を行う。④ 令和4年度からのKOマウスの行動解析の準備を行う。であった。
① Zdhhc18の局在解析については種々のzdhhc18の抗体を用いた免疫染色法では明確なシグナルが得られなかった。これら抗体を用いて脳画分タンパクのウエスタンブロットを行ったが明確なバンドは得られなかった。（zdhhc18発現細胞ではバンドがみられた）。タンパク発現が低い可能性が高い。② 初代培養神経細胞にZdhhc18を強制発現させる実験を行い形態変化を観察した。Zdhhc18の発現が高いと初代培養神経細胞が死ぬことがわかりプロモーターを変えたプラスミドを作成し発現量も低下させて導入し解析している ③ Zdhhc18欠損マウスの大脳における神経回路形成や神経細胞形態を解析するため、妊娠15日の胎児の大脳に蛍光タンパク質レポータープラスミドをin utero electrophoresis (子宮内電気穿孔法)で導入した。まだ数匹の仔体しか得られていないがすすめて行く予定である。④ GONAD法を用いたZdhhc18欠損マウスの作成を行い、現在6代目までバッククロスが終了している。現在は行動解析試験に向けて6代目ヘテロマウス同士の交配をすすめ野生型、欠損型マウス 雌雄各20匹づつ確保しようとしている。
①から④はいずれも実験系を確立することができ局所解析以外は何らかの結果を得ることができると期待される。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
Zdhhc18の局在解析については検討を重ねたが発現が低いためなのかSLENDR法でも免疫染色法でも明確な結果が得られなかった。種々のzdhhc18の抗体を用いても免疫染色で明らかなシグナルが得られないことから脳画分を用いたウエスタンブロットを行ったが明確なバンドは得られなかった。（zdhhc18発現細胞ではバンドがみられた）一方RNAを用いた定量PCRでは欠損マウスと野生型マウスでは明確な差がみられた。転写後、あるいは翻訳後に分解される可能性も考えられるため確認したい。
一方初代神経培養細胞を用いた強制発現による形態変化解析、発現欠損による形態変化解析については所持していた発現プラスミドの発現が高すぎるためプロモーターを変更する、誘導系のプラスミドを構築しなおすなどの工程が必要であった。現在はこれを終了し解析を数度行っている。
野生型マウス、KOマウスの大脳発達段階における神経細胞の形態、伸長の比較についても子宮内電気穿孔法によるGFPの導入を始めたところである。子宮内電気穿孔法でC57BL6の子宮内に導入するのは（通常ICRが使用される）難度の高い技術でありまだ明確な結果が出ていない。しかしながら系は立ち上げたので解析の回数を重ね今年度中には何らかの結論を出す予定である。
行動解析の準備に関してはおおむね計画通りであり今年中に行動解析は開始できる。
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| 今後の研究の推進方策 |
① 初代培養神経細胞にZdhhc18を強制発現させる実験を行い形態変化を観察する ② 初代培養神経細胞にZdhhc18のｓｈRNA を発現させ形態変化を観察する ③ Zdhhc18欠損マウスの海馬より初代培養神経細胞を作成し野生型マウス由来の初代培養神経細胞と比較し形態、伸長等に差が見られるか比較する
④ Zdhhc18欠損マウスの大脳における神経回路形成や神経細胞形態を解析するため、妊娠15日の胎児大脳にGFPを子宮内電気穿孔法で導入し野生型マウス脳と比較る ⑤ 野生型マウスの大脳にウイルスベクターを用いてZdhhc18発現誘導あるいは欠損誘導させた場合の神経の形態変化を調べる。⑥ Zdhhc18欠損マウスの行動解析を行う。統合失調症様症状の発出があるか確認する
⑦ Zdhhc18タンパクが翻訳後分解を受けている可能性を確認するためにプロテアソーム阻害剤、Wnt シグナル阻害剤の存在下でウエスタンブロットを行う
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| 次年度使用額が生じた理由 |
物品費に関しては研究室に既に試薬などのストックがあり今年度の支出が少なかったため
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