| 研究課題/領域番号 |
21K06377
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| 研究機関 | 慶應義塾大学 |
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研究代表者 |
山崎 世和 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 助教 (60581402)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 抑制性シナプス / アデノ随伴ウイルス / シナプス伝達 / シナプス分子構成 |
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| 研究実績の概要 |
脳には様々な種類の抑制性神経細胞が存在するが、それぞれのシナプスに集積する分子の構成は明らかになっていない。本研究では、様々な分類が存在する抑制性シナプスのシナプス後部において、「どの抑制性シナプスにどの分子が局在しているのか？」という学術的問いを明らかにし、さらにそれらの分子を人為的に操作することによって、特定の抑制性シナプスを得意的に操作する技術を開発することを目的としている。
三年間の研究期間の二年目である本年度は、初年度で検討したAAVを用いた遺伝子導入方を活用し、脳内への目的遺伝子の発現系確立に焦点を当てて研究を遂行した。本研究では、大脳皮質錐体細胞における抑制性シナプス後部分子を精製・同定するため、近接依存性ビオチン化標識酵素TurboIDにALFAタグ・膜貫通ドメインを導入したタンパク質(labeling module)を錐体細胞へ、さらにこのタンパク質を特定の抑制性シナプスへ局在させるためのGPIアンカーを融合した抗ALFAナノボディ（targeting module）を抑制性神経細胞へ、発現させる。初めに、抑制性シナプス全般をラベルできるか検討するために、SynプロモーターとmiRNAの標的配列を組み合わせた抑制性神経細胞特異的AAVベクターにlabeling moduleを組み込んだ。また、labeling moduleはCaMKIIプロモーターの下流に組み込んだ。これらのAAVを血液脳関門透過型のCapsidで作成し、大脳皮質に直接AAVを打ち込みWestern blottingと免疫染色をしたところ、Targeting module、Labeling moduleのどちらも、発現していることが確認された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
昨年度の遅れを十分に挽回できなかったため「やや遅れている」としたが、本年度は、シナプスを標的化して構成因子をラベルするためのTargeting module、Labeling module双方のAAV化に成功し、さらにこれらを実際に脳に打ち込んだ。そして人工的に設計・作成したこれらのmoduleが実際に脳の神経細胞で発現することを確認したことから、大きな進捗があったと言える。
しかしながら、AAVの大脳皮質への直接投与での発現が見られた一方で、本来計画していた眼窩静脈洞を介した血中投与と大脳皮質全体への発現では、目的タンパク質の発現は確認できなかったため、シナプス後部分子のラベル・精製と同定までには至らなかった。血中投与による遺伝子発現が誘導できなかった原因としては、ウイルスのタイターや質が良くなかった可能性が考えられ、これを改善が当面の課題と言える。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、今年度に脳神経細胞での発現が確認されたTargeting module、Labeling moduleを用いて、実際に抑制性シナプスのシナプス後部分子のラベル・精製・同定を進める。現在作成したAAVで抑制性シナプスを包括的なラベル・精製を進めると同時に、個々の種類の抑制性シナプスを標的とするため、Cre依存的に遺伝子を発現するDIOやFLEXが組み込まれたAAVベクターにTargeting moduleを搭載したものを作成し、それぞれのシナプスにおける構成因子の網羅的道程を目指す。これらの結果から同定された特異的分子に対しては、その生理機能の解明を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度は、当初の計画を変更し、本研究で用いる人工タンパク質の大脳皮質錐体細胞と抑制性神経細胞へのAAVによる発現に焦点を当てて研究を遂行した。そのため、当初予定していた実験の実施が延期されることとなり、次年度使用額が生じることとなった。これらの予算は、当初の予定より遅れてしまったが、次年度実施するタンパク質のラベル・精製・同定、とそれに引き続く解析に使用する計画である。
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