| 研究課題/領域番号 |
21K06398
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| 研究機関 | 東京慈恵会医科大学 |
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研究代表者 |
中村 行宏 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (40460696)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | シナプス前終末 / カルシウム / シナプス伝達 / Held萼状シナプス |
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| 研究実績の概要 |
脳幹聴覚伝導路上の萼状シナプスの巨大シナプス前終末において、活動電位非依存的に発生する一過性の上昇を‘Caスパーク’と呼ぶ。CMOSカメラを用いたCaイメージングによって、Caスパークは聴覚獲得前の生後１週齢のシナプス前終末ではほとんど観察されないことが昨年度の研究によって明らかになっていた。そこで本年度は生後２週齢（以降）のシナプスに
焦点を絞って研究を進めた。
ガラスパッチ電極よりシナプス前終末に高親和性の蛍光Ca感受性色素Calbryteを注入し、新たに導入した共焦点レーザー顕微鏡を用いてシナプス前終末内におけるCaスパークの発生部位を調べた。Caスパークは、主にシナプス前終末の枝分かれして膨大した先端部（swellings）で発生し、軸索や軸索と接続する細い幹（stalk）ではほとんど観察されなかった。電位依存性カルシウムチャネルCaV2.1阻害剤omega-Agatoxinを投与したところ、Caスパークの振幅は微減したが、発生頻度には影響しなかった。電位依存性カルシウムチャネルを介したCaイオン流入はCaスパーク発生の主因ではないと考えられる。さらにCaイメージングと同時に後シナプスの台形体核神経細胞からシナプス後電流を記録したところ、Caスパークの発生は微小シナプス電流と同期する様子は認められなかった。Caスパークはシナプス伝達には直接関与しない生理現象である可能性が示された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
昨年度のコロナ禍による研究機器納入や実験進捗の遅延をほぼ回復し、およそ計画当初のスケジュールに沿って進展している。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまではシナプス前末端へ直接パッチクランプしたガラス電極からCa感受性蛍光色素を導入していたが、技術的に困難な実験であり効率はよくなかった。そこでHeld萼状シナプスの巨大シナプス前終末に遺伝的にコードされたCaセンサータンパク質GCaMP6fを発現した動物の作成をすすめている。この動物を用いることにより、Caイメージングに際してシナプス前終末へパッチクランプ必要がなくなり、実験効率の向上が期待できる。シナプス前終末の膜電位を記録しないため、通常のシナプスでは自発発火によるCa上昇と発火によらないCa sparkを識別できない。しかし、脳幹スライス中のHeld萼状シナプスのin situ標本では巨大シナプス前終末に自発発火が生じないことが知られており、Caイメージングによって観察されるCa濃度上昇はすべてCa sparkであるとみなせる。Ca sparkの発生機序を調べる最終年度の薬理学的・分子生物学的実験ではこの動物を使用していきたい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
使用動物数削減の観点から動物購入を他プロジェクトと共有し、購入飼育費を実質的に他予算で賄えたこと、コロナ禍による学会参加の自粛やオンライン参加による旅費計上がなくなったため繰り越しが生じた。これにより2023年度に遺伝子組み換え動物の作成が可能となった。
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