| 研究課題/領域番号 |
21K06557
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
磯部 洋輔 国立研究開発法人理化学研究所, 生命医科学研究センター, 副チームリーダー (80724335)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2026-03-31
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| キーワード | 好酸球 / リポキシデーション / 12/15-LOX / ケミカルバイオロジー |
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| 研究実績の概要 |
多価不飽和脂肪酸(PUFA)は、細胞内においてリポキシゲナーゼ(LOX)などのPUFA代謝酵素によって酸化され、生成した代謝物の一部はlipid-derived electorphile（LDE）としてタンパク質のシステイン残基等を非可逆的に修飾（リポキシデーション）する。本研究では、研究代表者らがこれまでに着目してきたPUFA代謝酵素12/15-LOXとその発現細胞である好酸球に着目し、12/15-LOX由来LDEによるリポキシデーションの標的タンパク質の同定とその機能の解明を目指している。
本年度は、まずPUFAのケミカルプローブ（アルキン脂肪酸）を用い、クリックケミストリーを利用して好酸球に内因性に発現する12/15-LOXによるリポキシデーションの検出条件の最適化を行った。全身性に好酸球を誘導したIL-5トランスジェニック（Tg）マウスの腹腔細胞（約70%が好酸球）を回収後、アルキン脂肪酸を処理し、細胞内でLDEに代謝、細胞内タンパク質を修飾させた。その後、クリックケミストリーによって修飾されたタンパク質に蛍光分子を付加し、SDS-PAGEで検出した。その結果、多くのタンパク質の蛍光バンドが認められた。また、それらの蛍光バンドの多くが12/15-LOXの阻害剤処理によって消失、あるいは減少した。さらに、12/15-LOX欠損 IL-5 Tgマウスの腹腔細胞においてもアルキン脂肪酸修飾タンパク質のシグナルが顕著に減少したことから、アルキン脂肪酸によって好酸球の12/15-LOX依存的なリポキシデーションが捉えられているものと考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
リポキシデーションによる修飾タンパク質を検出・同定できるケミカルプローブとしてアルキン脂肪酸を用い、好酸球における修飾タンパク質の検出に成功しており、当初の仮説、及び計画通りの研究の進展となっている。 さらに、12/15-LOXの阻害剤や遺伝子欠損を用いたアプローチによって本酵素依存的なリポキシデーションが捉えられていることが示唆され、おおむね順調な進展であると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでの研究により見出された12/15-LOX依存的なリポキシデーションの標的タンパク質を同定する。具体的には、好酸球にアルキン脂肪酸を処理し、修飾されたタンパク質をビオチン-ストレプトアビジンのシステムで濃縮し、プロテオミクス解析による同定を行う。その際は、12/15-LOX阻害剤などの複数条件間で定量的な解析が可能となるよう、ペプチドバーコーディングを用いた相対定量プロテオミクスの技術をアルキン脂肪酸の濃縮技術と組み合わせ、より高い精度で12/15-LOX依存的な修飾タンパク質の同定を行う。
また、一般にこのようなリポキシデーションはシステインをはじめとする特定のアミノ酸に生じるものと考えられていることから、そうしたアミノ酸を包括的に捉えるケミカルプローブを使ったリポキシデーションの標的部位の同定も行う。具体的には、システイン反応性のヨードアセトアミドを母骨格としたケミカルプローブを好酸球に処理し、ケミカルプローブが結合したペプチドを濃縮し、LC-MS/MSにより濃縮されたペプチド、及びケミカルプローブにより修飾されたアミノ酸の同定を行う。この時、得られたケミカルプローブ修飾ペプチドの中からPUFA処理によって阻害されるものを抽出することで、リポキシデーションの標的候補をアミノ酸レベルで同定する。
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